للبدء ، خذ واحدة من الحصة سعة 75 ميكرولترا تحتوي على ملليغرام واحد من الخرزات المغناطيسية المغلفة بالستربتافيدين المرتبطة بالحمض النووي وقم بإزالة المادة الطافية باستخدام الرف المغناطيسي. اغسل الخرزات ب 200 ميكرولتر من مخزن التحميل المؤقت. ثم أعد تعليق الخرزات في 75 ميكرولترا من مخزن التحميل المؤقت واخلطها برفق عن طريق الماصة.
بعد ذلك ، أضف مجمع التعرف على الأصل بتركيز نهائي قدره 37.5 نانومولار إلى الحمض النووي المرتبط بالخرز واحتضان التفاعل لمدة خمس دقائق عند 30 درجة مئوية مع 800 دورة في الدقيقة تحريض. أضف CDC6 بتركيز نهائي قدره 50 نانومولار واحتضان التفاعل كما هو موضح من قبل. ثم أضف Mcm2-7 Cdt1 بتركيز نهائي قدره 100 نانومول واحتضان التفاعل لمدة 20 دقيقة كما هو موضح سابقا.
بعد ذلك ، أضف DDK بتركيز نهائي قدره 100 نانومولار واحتضان بالمثل لمدة 30 دقيقة. بعد إزالة المادة الطافية ، اغسل الحمض النووي المرتبط بالخرز الذي يحتوي على سداسيات Mcm-2-7 المفسفرة مع 200 ميكرولتر من محلول الغسيل عالي الملح. امزجه عن طريق السحب ، مما يضمن إعادة استخدام الخرز بالكامل.
بعد ذلك ، قم بإزالة المخزن المؤقت وغسل الخرز مرة واحدة باستخدام 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت CMG. لتجميع وتنشيط CMG المسمى بالفلورسنت على الحمض النووي المرتبط بالخرز ، قم بإزالة المخزن المؤقت CMG وإعادة تعليق الحبيبات المرتبطة بالحمض النووي في 50 ميكرولترا من المخزن المؤقت CMG المكمل بخمسة مليمول ADP. بعد ذلك ، امزج جميع المكونات المذكورة على الشاشة في أنبوب واحد وضعها على الجليد.
أضف على الفور الحمض النووي المرتبط بالخرز المعاد تعليقه إلى مزيج البروتين. احتضان التفاعل لمدة 15 دقيقة عند 30 درجة مئوية مع تحريض 800 دورة في الدقيقة. اغسل الخرزة بالتتابع باستخدام المخزن المؤقت HSW والمخزن المؤقت CMG.
بعد إزالة المخزن المؤقت ، أعد تعليق CMG الذي يحتوي على حبات مغناطيسية مرتبطة بالحمض النووي في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للشطف ، ثم احتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة مع تحريض 800 دورة في الدقيقة. ضع الأنبوب في رف مغناطيسي واترك الخرزات تجمع لمدة خمس دقائق. اجمع بعناية المادة الطافية التي تحتوي على مجمعات DNA-CMG المستخلصة دون تعطيل الخرزات المستقرة ونقلها إلى أنبوب جديد.
لضمان عدم وجود خرز في المحلول ، ضع المادة الطافية المجمعة مرة أخرى في رف مغناطيسي واحتفظ بها لمدة خمس دقائق أخرى بعناية. جمع طاف ونقله إلى أنبوب جديد. أضف 1،400 ميكرولتر من المخزن المؤقت CMG إلى 200 ميكرولتر من المادة الطافية.
العينة جاهزة الآن للتصوير بجزيء واحد.
