Neem om te beginnen een aliquot van 75 microliter met daarin één milligram DNA-gebonden met streptavidine gecoate magnetische kralen en verwijder het supernatans met het magnetische rek. Was de korrels met 200 microliter laadbuffer. Resuspendeer de korrels vervolgens in 75 microliter laadbuffer en meng voorzichtig door te pipetteren.
Voeg vervolgens het oorsprongsherkenningscomplex in een eindconcentratie van 37,5 nanomolaar toe aan het kraalgebonden DNA en incubeer de reactie gedurende vijf minuten bij 30 graden Celsius met 800 omwentelingen per minuut agitatie. Voeg CDC6 toe in een eindconcentratie van 50 nanomolair en incubeer de reactie zoals eerder gedemonstreerd. Voeg vervolgens Mcm2-7 Cdt1 toe in een eindconcentratie van 100 nanomolair en incubeer de reactie gedurende 20 minuten zoals eerder aangetoond.
Voeg daarna DDK toe in een eindconcentratie van 100 nanomolaar en incubeer op dezelfde manier gedurende 30 minuten. Was na het verwijderen van het supernatant het parelgebonden DNA dat gefosforyleerde Mcm-2-7-hexameren bevat met 200 microliter wasbuffer met veel zout. Meng door te pipetteren en zorg ervoor dat de korrels volledig zijn geresuspendeerd.
Verwijder vervolgens de buffer en was de korrels een keer met 200 microliter CMG-buffer. Om het fluorescerend gelabelde CMG op parelgebonden DNA te assembleren en te activeren, verwijdert u de CMG-buffer en suspendeert u de DNA-gebonden kralen in 50 microliter CMG-buffer aangevuld met vijf millimolaire ADP. Meng vervolgens alle componenten die op het scherm worden vermeld in één buis en plaats deze op ijs.
Voeg het geresuspendeerde parelgebonden DNA onmiddellijk toe aan de eiwitmix. Incubeer de reactie gedurende 15 minuten bij 30 graden Celsius met 800 RPM agitatie. Was de kraal achtereenvolgens met HSW-buffer en CMG-buffer.
Nadat de buffer is verwijderd, resuspendeert u de CMG met DNA-gebonden magnetische kralen in een elutiebuffer van 200 microliter en incubeert u vervolgens een uur bij kamertemperatuur met 800 RPM agitatie. Plaats de tube in een magnetisch rek en laat de kralen vijf minuten verzamelen. Verzamel voorzichtig het supernatans met de geëlueerde DNA-CMG-complexen zonder de bezonken korrels te verstoren en breng het over naar een nieuw buisje.
Om ervoor te zorgen dat er geen parels in de oplossing achterblijven, plaatst u het verzamelde supernatans opnieuw in een magnetisch rek en bewaart u het nog vijf minuten zorgvuldig. Verzamel het supernatans en breng het over in een nieuwe buis. Voeg 1.400 microliter CMG-buffer toe aan de 200 microliter supernatant.
Het monster is nu klaar voor beeldvorming met één molecuul.
