먼저 DNA 결합 스트렙타비딘 코팅 마그네틱 비드 1mg이 포함된 75마이크로리터 부분 표본 1개를 취하고 마그네틱 랙으로 상층액을 제거합니다. 200 마이크로리터의 로딩 버퍼로 비드를 세척합니다. 그런 다음 비드를 75 마이크로리터의 로딩 버퍼에 재현탁시키고 피펫팅으로 부드럽게 혼합합니다.
다음으로, 최종 농도 37.5 나노몰의 기원 인식 복합체를 비드 결합 DNA에 추가하고 섭씨 30도에서 분당 800회 교반으로 5분 동안 반응을 배양합니다. 50 나노몰의 최종 농도에서 CDC6를 첨가하고 이전에 시연된 대로 반응을 배양합니다. 그런 다음 100 나노몰의 최종 농도에서 Mcm2-7 Cdt1을 첨가하고 이전에 설명한 대로 20분 동안 반응을 배양합니다.
그 후, 100 나노몰의 최종 농도에서 DDK를 첨가하고 30 분 동안 유사하게 배양합니다. 상층액을 제거한 후 인산화된 MCM-2-7 헥사머를 함유한 비드 결합 DNA를 200마이크로리터의 고염 세척 완충액으로 세척합니다. 피펫팅으로 혼합하여 비드가 완전히 재현탁되도록 합니다.
다음으로 완충액을 제거하고 200마이크로리터의 CMG 완충액으로 비드를 한 번 세척합니다. 형광 표지된 CMG를 비드 결합 DNA에 조립하고 활성화하려면 CMG 완충액을 제거하고 DNA 결합 비드를 5밀리몰 ADP가 보충된 50마이크로리터의 CMG 완충액에 재현탁시킵니다. 그런 다음 화면에 언급 된 모든 구성 요소를 하나의 튜브에 섞어 얼음 위에 놓습니다.
재현탁된 bead-bound DNA를 단백질 혼합물에 즉시 첨가합니다. 섭씨 30도에서 800RPM의 교반으로 15분 동안 반응을 배양합니다. HSW 완충액과 CMG 완충액으로 비드를 순차적으로 세척합니다.
완충액을 제거한 후 DNA 결합 마그네틱 비드가 포함된 CMG를 200마이크로리터의 용출 완충액에 재현탁시킨 다음 실온에서 800RPM 교반으로 1시간 동안 배양합니다. 튜브를 마그네틱 랙에 놓고 비드를 5분 동안 수집합니다. 침전된 비드를 방해하지 않고 용리된 DNA-CMG 복합체를 포함하는 상층액을 조심스럽게 수집하여 새 튜브로 옮깁니다.
용액에 비드가 남지 않도록 수집한 상층액을 마그네틱 랙에 다시 넣고 5분 더 조심스럽게 보관합니다. 상층액을 모아 새 튜브로 옮깁니다. 1, 400 마이크로 리터의 CMG 버퍼를 200 마이크로 리터의 상층액에 첨가하십시오.
이제 샘플은 단일 분자 이미징을 위한 준비가 되었습니다.
