Ensemblemontering og aktivering av fluorescerende merket CMG på magnetisk perlebundet DNA for enkeltmolekylavbildning

For å begynne, ta en 75 mikroliters alikvot som inneholder ett milligram DNA-bundne streptavidin-belagte magnetiske perler og fjern supernatanten med magnetstativet. Vask perlene med 200 mikroliter lastebuffer. Suspender deretter perlene i 75 mikroliter lastebuffer og bland forsiktig ved pipettering.

Deretter legger du til opprinnelsesgjenkjenningskomplekset ved en endelig konsentrasjon på 37,5 nanomolar til det perlebundne DNA-et og inkuberer reaksjonen i fem minutter ved 30 grader Celsius med 800 omdreininger per minutt omrøring. Tilsett CDC6 ved en endelig konsentrasjon på 50 nanomolar og inkuber reaksjonen som vist før. Tilsett deretter Mcm2-7 Cdt1 i en endelig konsentrasjon på 100 nanomolar og inkuber reaksjonen i 20 minutter som vist tidligere.

Etter det, tilsett DDK i en endelig konsentrasjon på 100 nanomolar og inkuber på samme måte i 30 minutter. Etter å ha fjernet supernatanten, vask det perlebundne DNA-et som inneholder fosforylerte Mcm-2-7 hexamere med 200 mikroliter høysaltvaskebuffer. Bland ved pipettering, og sørg for at perlene er helt opphengt.

Fjern deretter bufferen og vask perlene én gang med 200 mikroliter CMG-buffer. For å sette sammen og aktivere den fluorescerende merkede CMG på perlebundet DNA, fjern CMG-bufferen og suspender de DNA-bundne perlene på nytt i 50 mikroliter CMG-buffer supplert med fem millimolar ADP. Deretter blander du alle komponentene som er nevnt på skjermen i ett rør og legger det på is.

Tilsett umiddelbart det resuspenderte perlebundne DNA-et til proteinblandingen. Inkuber reaksjonen i 15 minutter ved 30 grader Celsius med 800 RPM omrøring. Vask strengen sekvensielt med HSW-buffer og CMG-buffer.

Etter å ha fjernet bufferen, resuspender CMG-en som inneholder DNA-bundne magnetiske perler i 200 mikroliter elueringsbuffer, og inkuber deretter ved romtemperatur i en time med 800 RPM omrøring. Plasser røret i et magnetisk stativ og la perlene samles i fem minutter. Samle forsiktig supernatanten som inneholder de eluerte DNA-CMG-kompleksene uten å forstyrre de sedimenterte perlene og overfør den til et nytt rør.

For å sikre at det ikke blir igjen perler i løsningen, plasser den oppsamlede supernatanten igjen i et magnetisk stativ og oppbevar forsiktig i ytterligere fem minutter. Samle supernatanten og overfør den til et nytt rør. Tilsett 1 400 mikroliter CMG-buffer til 200 mikroliter supernatant.

Prøven er nå klar for avbildning av enkeltmolekyler.