Para comenzar, tome una alícuota de 75 microlitros que contenga un miligramo de perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina unidas al ADN y retire el sobrenadante con la rejilla magnética. Lave las cuentas con 200 microlitros de tampón de carga. A continuación, vuelva a suspender las perlas en 75 microlitros de tampón de carga y mezcle suavemente mediante pipeteo.
A continuación, agregue el complejo de reconocimiento de origen a una concentración final de 37,5 nanomolares al ADN unido a perlas e incube la reacción durante cinco minutos a 30 grados Celsius con una agitación de 800 revoluciones por minuto. Agregue CDC6 a una concentración final de 50 nanomolares e incube la reacción como se demostró anteriormente. A continuación, añada Mcm2-7 Cdt1 a una concentración final de 100 nanomolares e incube la reacción durante 20 minutos como se ha demostrado anteriormente.
Después de eso, agregue DDK a una concentración final de 100 nanomolares e incube de manera similar durante 30 minutos. Después de eliminar el sobrenadante, lave los hexámeros de Mcm-2-7 fosforilados que contienen ADN unido a perlas con 200 microlitros de tampón de lavado con alto contenido de sal. Mezcle mediante pipeteo, asegurándose de que las perlas se vuelvan a suspender por completo.
A continuación, retire el tampón y lave las perlas una vez con 200 microlitros de tampón CMG. Para ensamblar y activar el CMG marcado con fluorescencia en el ADN unido a las perlas, retire el tampón de CMG y vuelva a suspender las perlas unidas al ADN en 50 microlitros de tampón de CMG suplementado con ADP de cinco milimolares. A continuación, mezcle todos los componentes mencionados en la pantalla en un tubo y colóquelo sobre hielo.
Agregue inmediatamente el ADN unido a perlas resuspendido a la mezcla de proteínas. Incubar la reacción durante 15 minutos a 30 grados centígrados con agitación de 800 RPM. Lave el cordón secuencialmente con tampón HSW y tampón CMG.
Después de retirar el tampón, vuelva a suspender el CMG que contiene perlas magnéticas unidas al ADN en 200 microlitros de tampón de elución, luego incube a temperatura ambiente durante una hora con agitación de 800 RPM. Coloque el tubo en una rejilla magnética y deje que se recojan las cuentas durante cinco minutos. Recoja cuidadosamente el sobrenadante que contiene los complejos ADN-CMG eluidos sin interrumpir las perlas sedimentadas y transfiéralo a un nuevo tubo.
Para asegurarse de que no queden perlas en la solución, vuelva a colocar el sobrenadante recogido en una rejilla magnética y manténgalo durante otros cinco minutos con cuidado. Recoja el sobrenadante y transfiéralo a un nuevo tubo. Añadir 1.400 microlitros de tampón CMG a los 200 microlitros de sobrenadante.
La muestra ya está lista para la obtención de imágenes de una sola molécula.
