Başlamak için, bir miligram DNA'ya bağlı streptavidin kaplı manyetik boncuk içeren 75 mikrolitrelik bir alikot alın ve süpernatanı manyetik raf ile çıkarın. Boncukları 200 mikrolitre yükleme tamponu ile yıkayın. Daha sonra boncukları 75 mikrolitre yükleme tamponunda tekrar süspanse edin ve pipetleyerek hafifçe karıştırın.
Daha sonra, boncuk bağlı DNA'ya 37.5 nanomolar nihai konsantrasyonda köken tanıma kompleksini ekleyin ve reaksiyonu dakikada 800 devir çalkalama ile 30 santigrat derecede beş dakika inkübe edin. CDC6'yı 50 nanomolar nihai konsantrasyonda ekleyin ve reaksiyonu daha önce gösterildiği gibi inkübe edin. Daha sonra 100 nanomolar final konsantrasyonunda Mcm2-7 Cdt1 ekleyin ve reaksiyonu daha önce gösterildiği gibi 20 dakika inkübe edin.
Bundan sonra, 100 nanomolar final konsantrasyonunda DDK ekleyin ve benzer şekilde 30 dakika inkübe edin. Süpernatanı çıkardıktan sonra, fosforile Mcm-2-7 heksamer içeren boncuk bağlı DNA'yı 200 mikrolitre yüksek tuzlu yıkama tamponu ile yıkayın. Pipetleme ile karıştırın ve boncukların tamamen yeniden süspanse edildiğinden emin olun.
Daha sonra, tamponu çıkarın ve boncukları bir kez 200 mikrolitre CMG tamponu ile yıkayın. Floresan etiketli CMG'yi boncuk bağlı DNA üzerine monte etmek ve aktive etmek için, CMG tamponunu çıkarın ve DNA'ya bağlı boncukları beş milimolar ADP ile desteklenmiş 50 mikrolitre CMG tamponunda yeniden süspanse edin. Ardından, ekranda belirtilen tüm bileşenleri tek bir tüpte karıştırın ve buzun üzerine yerleştirin.
Yeniden askıya alınmış boncuk bağlı DNA'yı hemen protein karışımına ekleyin. Reaksiyonu 800 RPM çalkalama ile 30 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin. Boncuğu HSW tamponu ve CMG tamponu ile sırayla yıkayın.
Tamponu çıkardıktan sonra, DNA'ya bağlı manyetik boncuklar içeren CMG'yi 200 mikrolitre elüsyon tamponunda yeniden süspanse edin, daha sonra 800 RPM çalkalama ile oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Tüpü manyetik bir rafa yerleştirin ve boncukların beş dakika boyunca toplanmasına izin verin. Ayrıştırılmış DNA-CMG komplekslerini içeren süpernatanı, çökelmiş boncukları bozmadan dikkatlice toplayın ve yeni bir tüpe aktarın.
Çözeltide boncuk kalmadığından emin olmak için, toplanan süpernatanı tekrar manyetik bir rafa yerleştirin ve beş dakika daha dikkatlice tutun. Süpernatanı toplayın ve yeni bir tüpe aktarın. 200 mikrolitre süpernata 1.400 mikrolitre CMG tamponu ekleyin.
Numune artık tek moleküllü görüntüleme için hazırdır.
