在商业设置中执行单分子成像,将双光束光镊与共聚焦显微镜相结合。使用进样通道 1 进行磁珠捕获,通道 2 用于 DNA 蛋白复合物结合,通道 3 用于检查 CMG 的存在,通道 4 和 5 作为蛋白质储液库和缓冲液交换位置。在进样口中以 0.5 bar 的恒定压力将所有溶液流入流通池。
然后关闭通道 4 和 5 中的流量。在初始流动所有溶液后,将压力降低至 0.2 bar。将陷印激光器移动到通道 1,直到每个光阱中捕获一个珠子。
通过在按下扳机的同时移动操纵杆,将捕获的珠子移动到通道 2。在不按下扳机的情况下使用操纵杆,通过将右侧磁珠移向和远离左侧磁珠,直到 DNA 系绳被捕获,来捕获 DNA CMG 复合物。将微珠移至通道 3,并立即停止所有通道中的流动。
在激发激光面板中将 561 纳米激光功率调整为 4 微瓦,然后在通道 3 中对 DNA 进行一帧测试扫描。如果存在,CMG 将显示为二维衍射极限光斑。在这种情况下,将 DNA 系绳移动到通道 4 或 5 进行成像。
否则,请重新打开流路,丢弃珠子并重复这些步骤。在通道 4 或 5 中,在力谱面板中输入 2 皮克顿,然后单击启用按钮以启动力钳。一旦初始张力达到 2 皮顿,再次单击力谱面板中的启用按钮,在成像前禁用力夹。
单击图像扫描面板中的开始扫描按钮。使用 561 纳米激光器以 4 微瓦的功率每 5 秒对荧光 CMG 进行一次成像,在物镜处测得。在无聚集反应中,CMG 表现为离散、对称的衍射限制点,稀疏地挤满了 DNA。
相反,聚集体不那么离散,有时是不对称的斑点挤满了较长的 DNA。如果分析成功执行并实现了纯化蛋白的高纯度,则可以观察到 CMG 在 ATP 存在下的长距离运动。