이중 빔 광학 핀셋과 컨포칼 현미경을 결합한 상업적 설정에서 단일 분자 이미징을 수행합니다. 주입 채널 1은 비드 트래핑, 채널 2는 DNA 단백질 복합체 결합, 채널 3은 CMG의 존재 여부를 확인하고, 채널 4 및 5는 단백질 저장소 및 완충액 교환 위치로 사용합니다. 주입 포트에서 0.5bar의 일정한 압력으로 모든 용액을 플로우 셀로 흘립니다.
그런 다음 채널 4와 5의 흐름을 끕니다. 처음에 모든 용액을 흘린 후 압력을 0.2bar로 줄입니다. 각 광학 트랩에 하나의 비드가 걸릴 때까지 트래핑 레이저를 채널 1로 이동합니다.
방아쇠를 당기는 동안 조이스틱을 움직여 갇힌 구슬을 채널 2로 이동합니다. 방아쇠를 누르지 않고 조이스틱을 사용하면 DNA 테더가 갇힐 때까지 오른쪽 비드를 왼쪽 비드 쪽으로 움직이거나 왼쪽 비드에서 멀어지게 하여 DNA CMG 복합체를 낚아챕니다. 비드를 채널 3으로 이동하고 모든 채널의 흐름을 즉시 중지합니다.
여기 레이저 패널에서 561나노미터 레이저 출력을 4마이크로와트로 조정한 다음 채널 3에서 DNA의 1프레임 테스트 스캔을 수행합니다. 있는 경우 CMG는 2차원 회절 제한 점으로 나타납니다. 이 경우 이미징을 위해 DNA 테더를 채널 4 또는 5로 이동합니다.
그렇지 않으면 흐름을 다시 켜고 비드를 버리고 단계를 반복하십시오. 채널 4 또는 5에서 힘 분광법 패널에 두 개의 피코네톤을 입력하고 활성화 버튼을 클릭하여 힘 클램프를 시작합니다. 초기 장력이 두 피코네톤에 도달하면 force spectroscopy 패널에서 enable 버튼을 다시 클릭하여 이미징하기 전에 force clamp 를 비활성화합니다.
이미지 스캔 패널에서 스캔 시작 버튼을 클릭합니다. 대물렌즈에서 측정한 4마이크로와트의 출력으로 561나노미터 레이저로 5초마다 형광 CMG를 이미지화합니다. 응집이 없는 반응에서 CMG는 DNA를 드문드문 밀집하는 불연속적이고 대칭적인 회절 제한 점으로 나타났습니다.
반대로, 응집체는 덜 불연속적이며, 때로는 비대칭 덩어리가 더 긴 길이의 DNA를 차지합니다. 분석이 성공적으로 수행되고 정제된 단백질의 고순도가 달성되면 ATP가 있는 상태에서 CMG의 장거리 움직임을 관찰할 수 있습니다.
