Name: single-molecule imaging of nuclear transport
Uploaded: 2010-06-09T17:00:00
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Questo progetto è stato sostenuto dalla capacità Research Enhancement Grant (Bowling Green State University).

1. Preparazione del sistema cellulare per l&#39;esperimento di singola molecola <ol><li> Almeno una settimana di anticipo, iniziare una nuova cultura della linea cellulare HeLa da uno stock di scongelamento a 37 ° C e mettendo in un centimetro 25 2 fiasco cultura dei media con 5 ml, Incubare le cellule a 37 ° C entro il 5% di CO 2 incubatore per 24 ore ed è diviso almeno 3 volte al fine di fornire una condizione ottimale per le cellule. Tuttavia le cellule non dovrebbe essere diviso più di 20...

<ol>
	<li>Ma, J., Yang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Molecule+Snapshots+of+Three-Dimensional+Distribution+of+Transient+Interactions+in+Nuclear+Pore+Complex.">Single Molecule Snapshots of Three-Dimensional Distribution of Transient Interactions in Nuclear Pore Complex.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , (2010).</li><li>Sarma, A., Goryaynov, A., Yang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Molecule+Imaging+of+the+Calcium-Regulated+Nuclear+Pore+Permeability.">Single Molecule Imaging of the Calcium-Regulated Nuclear Pore Permeability.</a> , .</li><li>Yang, W., Musser, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+single+molecules+transiting+through+nuclear+pore+complexes+using+narrow-field+epifluorescence+microscopy.">Visualizing single molecules transiting through nuclear pore complexes using narrow-field epifluorescence microscopy.</a> Methods. 39, 316-328 (2006).</li><li>Yang, W., Gelles, J., Musser, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+single-molecule+translocation+through+nuclear+pore+complexes.">Imaging of single-molecule translocation through nuclear pore complexes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 12887-12892 (2004).</li></ol>

Bisogna fare attenzione ad assicurare un adeguato colocalizzazione di molecole NE e singolo durante l&#39;esperimento. E &#39;inoltre importante fornire un alto rapporto segnale rumore, specialmente quando il segnale è basso a causa di etichettatura poveri o photobleaching. Precisione di localizzazione è limitata dal rumore di fondo (derivanti da out-of-focus fluorescenza, il rumore di lettura CCD, i fattori di corrente di buio e di altri).

single-molecule imaging of nuclear transport

L&#39;utilità dei singoli approcci di microscopia a fluorescenza molecola ha dimostrato di essere di avvalersi grande nel capire le reazioni biologiche negli ultimi dieci anni. L&#39;indagine delle interazioni molecolari con alta risoluzione temporale e spaziale in profondità all&#39;interno delle cellule è rimasta difficile a causa dei segnali intrinsecamente debole derivanti da singole molecole. Opere recenti di Yang et al. dimostrato che il piccolo campo epifluorescenza permette la visualizzazione di trasporto nucleocytoplasmic a livello di singola molecola. Con l&#39;approccio singola molecola, la cinetica importanti, come il tempo di trasporto nucleare ed efficienza, per le molecole segnale carico-dipendenti e indipendenti sono stati ottenuti. Qui abbiamo descritto un protocollo per l&#39;approccio metodologico con una migliore risoluzione spazio-temporale di 0,4 ms e 12 nm. La risoluzione migliore ci ha permesso di catturare transitori trasporto attivo ed eventi diffusione passiva attraverso i complessi poro nucleare (NPC) in semi-intatte le cellule. Ci aspettiamo che questo metodo da utilizzare per chiarire altri eventi vincolante e il traffico all&#39;interno delle cellule.

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Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport

Microscopia singola molecola approch fornito intuizioni romanzo in trasporto nucleare.

Singola molecola Imaging dei trasporti nucleari

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the ...

Research

JoVE Journal

Biology

Single Molecule Methods for Monitoring Changes in Bilayer Elastic Properties

Metodi di singola molecola per monitorare l&#39;evoluzione a doppio strato: Proprietà meccaniche

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein ...

Ricerca

Biologia

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

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Sistema automatico per le misure di fluorescenza singola molecola di superficie, immobilizzato Biomolecole

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) microscopy has been widely used to study the structure and dynamics of molecules of biological interest, ...

Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay

Osservazione diretta del DNA Enzimi Replica utilizzando un singolo-molecola di DNA Stretching Assay

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. ...

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

Singola molecola di imaging del regolamento Gene<em&gt; In vivo</em&gt; Utilizzo di attivazione Cotranslational da Cleavage (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

Combinando singola molecola di manipolazione e di imaging per lo studio delle interazioni proteina-DNA

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Studying DNA Looping by Single-Molecule FRET

Studiare Looping DNA a singola molecola FRET

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into ...

A Proteoliposome-Based Efflux Assay to Determine Single-molecule Properties of Cl- Channels and Transporters

A Proteoliposome-Based Efflux Assay to Determine Single-molecule Properties of Cl- Channels and Transporters

A Proteoliposome-Based Efflux Assay per determinare le proprietà singola molecola di Cl<sup&gt; -</sup&gt; Canali e trasportatori

The last 15 years have been characterized by an explosion in the ability to overexpress and purify membrane proteins from prokaryotic organisms as well as ...

Parallel High Throughput Single Molecule Kinetic Assay for Site-Specific DNA Cleavage

Analisi cinetica ad alta velocità ad alto rendimento parallela per cleavage del DNA specifico del sito

Site-specific DNA cleavage (SSDC) is a key step in many cellular processes, and it is crucial to gene editing. This work describes a kinetic assay capable ...

Quantificazione delle interazioni proteiche basata sull'imaging di singole molecole su cellule vive

Single-Molecule Measurement of Protein Interaction Dynamics Within Biomolecular Condensates

Autore in primo piano: Valutazione della dinamica proteina-condensato in cellule umane vive

Misura a singola molecola delle dinamiche di interazione proteica all'interno di condensati biomolecolari

Biomolecular condensates formed via liquid-liquid phase separation (LLPS) have been considered critical in cellular organization and an increasing number ...