Name: single-molecule imaging of nuclear transport
Uploaded: 2010-06-09T17:00:00
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Este proyecto fue financiado por la Beca de Investigación de la capacidad de mejora (Bowling Green State University).

1. Preparación del sistema celular para el experimento de una sola molécula <ol><li> Por lo menos una semana de antelación, iniciar un cultivo fresco de la línea celular HeLa de un stock de descongelación a 37 º C y poner en un frasco de cultivo de 25 cm 2 con 5 ml de medio, incuban las células a 37 º C en 5% de CO 2 incubadora durante 24 horas y se dividió al menos 3 veces a fin de ofrecer condiciones óptimas para las células. Sin embargo, las células no se debe dividir más de 20 ve...

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	<li>Ma, J., Yang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Molecule+Snapshots+of+Three-Dimensional+Distribution+of+Transient+Interactions+in+Nuclear+Pore+Complex.">Single Molecule Snapshots of Three-Dimensional Distribution of Transient Interactions in Nuclear Pore Complex.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , (2010).</li><li>Sarma, A., Goryaynov, A., Yang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Molecule+Imaging+of+the+Calcium-Regulated+Nuclear+Pore+Permeability.">Single Molecule Imaging of the Calcium-Regulated Nuclear Pore Permeability.</a> , .</li><li>Yang, W., Musser, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+single+molecules+transiting+through+nuclear+pore+complexes+using+narrow-field+epifluorescence+microscopy.">Visualizing single molecules transiting through nuclear pore complexes using narrow-field epifluorescence microscopy.</a> Methods. 39, 316-328 (2006).</li><li>Yang, W., Gelles, J., Musser, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+single-molecule+translocation+through+nuclear+pore+complexes.">Imaging of single-molecule translocation through nuclear pore complexes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 12887-12892 (2004).</li></ol>

Se debe tener cuidado para asegurar un adecuado colocalización de moléculas de NE y solo durante el experimento. También es importante proporcionar una relación señal ruido, sobre todo cuando la señal es baja debido a un etiquetado deficiente o photobleaching. Precisión de localización está limitada por el ruido de fondo (que surge de la fluorescencia fuera de foco, el ruido CCD de lectura, los factores de la corriente oscura y otros).

single-molecule imaging of nuclear transport

La utilidad de los enfoques de una sola molécula de microscopía de fluorescencia se ha demostrado ser de una gran disponibilidad en la comprensión de las reacciones biológicas en la última década. La investigación de las interacciones moleculares con alta resolución temporal y espacial profunda dentro de las células se ha mantenido un reto debido a las señales de por sí débil que surgen a partir de moléculas individuales. Obras recientes de Yang et al. demostrado que estrecha el campo de microscopía de epifluorescencia permite la visualización de transporte nucleocytoplasmic en el nivel de una sola molécula. Por el enfoque de una sola molécula, la cinética importantes, como el tiempo de transporte nuclear y la eficiencia, para las moléculas de carga depende de la señal e independientes se han obtenido. Aquí se describe un protocolo para el abordaje metodológico, con una mejor resolución espacio-temporal de 0,4 nm y 12 ms. La resolución mejorada que nos permitió la captura de transporte activo y eventos transitorios pasiva difusión a través de los complejos de poro nuclear (NPC) en semi-células intactas. Esperamos que este método es utilizado en el esclarecimiento de otros eventos de unión y el tráfico dentro de las células.

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Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport

Microscopía de una sola molécula approch proporcionan nuevos conocimientos sobre el transporte nuclear.

Imagen de una sola molécula de transporte nuclear

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the ...

Research

JoVE Journal

Biology

Single Molecule Methods for Monitoring Changes in Bilayer Elastic Properties

Métodos de una sola molécula para vigilar los cambios en las propiedades elásticas bicapa

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein ...

Investigación

Biología

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

Visualización de una sola molécula de ADN de replicación con microscopía de fluorescencia

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

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Sistema Automatizado de Soltero mediciones de fluorescencia de la molécula de superficie inmovilizada Biomoléculas

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) microscopy has been widely used to study the structure and dynamics of molecules of biological interest, ...

Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay

La observación directa de ADN Enzimas Replicar El uso de un ADN de una sola molécula de estiramiento de ensayo

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. ...

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

Una sola molécula de imágenes del Reglamento Gene<em&gt; En vivo</em&gt; Utilización de la activación cotraduccional por escisión (COTRAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

Combinando Manipulación sola molécula y de imagen para el estudio de las interacciones proteína-ADN

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Studying DNA Looping by Single-Molecule FRET

El estudio de ADN Looping por FRET sola molécula

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into ...

A Proteoliposome-Based Efflux Assay to Determine Single-molecule Properties of Cl- Channels and Transporters

A Proteoliposome-Based Efflux Assay to Determine Single-molecule Properties of Cl- Channels and Transporters

Un Proteoliposoma Basada Eflujo Ensayo para determinar una sola molécula Propiedades de Cl<sup&gt; -</sup&gt; Canales y Transportadores

The last 15 years have been characterized by an explosion in the ability to overexpress and purify membrane proteins from prokaryotic organisms as well as ...

Parallel High Throughput Single Molecule Kinetic Assay for Site-Specific DNA Cleavage

Ensayo cinético de molécula única de alto rendimiento paralelo para la escoja de ADN específica del sitio

Site-specific DNA cleavage (SSDC) is a key step in many cellular processes, and it is crucial to gene editing. This work describes a kinetic assay capable ...

Cuantificación de interacciones de proteínas basada en imágenes de molécula única de células vivas

Single-Molecule Measurement of Protein Interaction Dynamics Within Biomolecular Condensates

Autor destacado: Evaluación de la dinámica proteína-condensado en células humanas vivas

Medición de una sola molécula de la dinámica de interacción de proteínas dentro de condensados biomoleculares

Biomolecular condensates formed via liquid-liquid phase separation (LLPS) have been considered critical in cellular organization and an increasing number ...