Name: measuring calpain activity in fixed and living cells by flow cytometry
Uploaded: 2010-07-08T17:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry at JoVE.com

נתמך על ידי מענקים מכוני הקנדי לחקר בריאות, לוקמיה לימפומה וחברה של קנדה וקרן לימפומה של קנדה.

הכן ריאגנטים הערה: כל PBS מכיל Ca 2 + ו - Mg 2 + <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איתור מגיב הוסף 20μM 7-amino-4-chloromethyl coumarin, t-BOC, לאוצין, מתיונין אמיד (BOC-LM-CMAC) לטמפרטורת החדר PBS. כל השעיה תא ידרוש מגיב איתור 2ml. </li><li...

<ol>
	<li>Goll, D. E., Thompson, V. F., Li, H., Wei, W., Cong, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Calpain System. Physiol. Rev. 83, 731-801 (2003).</li><li>Niapour, M., Berger, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometric+Measurement+of+Calpain+Activity+in+Living+Cells.">Flow Cytometric Measurement of Calpain Activity in Living Cells.</a> Cytometry A. 71A, 475-485 (2007).</li><li>Leloup, L., Daury, L., Maz&#233;res, G., Cottin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+the+ERK/MAP+kinase+signalling+pathway+in+milli-calpain+activation+and+myogenic+cell+migration.">Involvement of the ERK/MAP kinase signalling pathway in milli-calpain activation and myogenic cell migration.</a> The International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 39, 1177-1189 (2007).</li></ol>

הפעילות calpain בתאים 32Dkit קבוע וחיים נקבע בפרוטוקול הווידאו הזאת. טיפול קו התא עם מעכב calpain PD150606 הביא עיכוב מלא של פעילות calpain בתאים. בנוסף, טיפול מעכב MEK1 PD98059 הביא עיכוב מלא של פעילות calpain בתאים. ERK הוא activator העיקריים של calpain-2 3. התוצאות מראות כי calpain-2 הפעילות העיקרי בתא...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>PBS BOC-LM-CMAC 4% paraformaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td> Dissolve 4g paraformaldehyde in 100mL PBS. In fume hood, heat sample with stirring until clear. Let cool then store at 4&deg;C</td>
</tr>
<tr>
<td>PD150606</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Use freshly reconstituted PD150606 for maximal calpain inhibition.</td>
</tr>
<tr>
<td>PD98059</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cell Signaling Technology</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>AlignFlow, AlignFlow plus fluorescent beads FACS tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LSR II</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Bioscience</td>
<td>&nbsp;</td>
<td> Supernatant of WEHI-3 cells is used as a source of IL-3 in these experiments. Each collection of WEHI-3 supernatant is titrated to determine the optimal concentration used for 32Dkit cell growth. </td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

measuring calpain activity in fixed and living cells by flow cytometry

Calpains נמצאים בכל מקום תאיים, סידן רגיש, פרוטאזות ציסטאין נייטרלי<sup&gt; 1</sup&gt;. Calpains ממלאים תפקידים מכריעים תהליכים פיזיולוגיים רבים, כולל איתות, שיפוץ cytoskeletal, רגולציה של אפופטוזיס ביטוי גנים התקדמות מחזור התא<sup&gt; 1</sup&gt;. Calpains היו מעורבים רבים, כולל מחלות dystrophies שרירים, סרטן, סוכרת, אלצהיימר וטרשת נפוצה<sup&gt; 1</sup&gt;. Calpain תקנה מורכב מובנת. רמות ה-mRNA וחלבון לתאם היטב עם פעילות, הגבלת שימוש בטכניקות של גן או חלבון הביטוי כדי למדוד את פעילות calpain. פרוטוקול זה מפרט וידאו assay תזרים cytometric שפותחו במעבדה שלנו למדידת פעילות calpain בתאים חיים קבוע. שיטה זו משתמשת המצע פלורסנט BOC-LM-CMAC, אשר ביקע במיוחד על ידי calpain, כדי למדוד את פעילות calpain.<sup&gt; 2</sup&gt; בסרטון הזה, פעילות calpain ב קבוע וחיים Murine לוקמיה תאים 32Dkit, לבד או כחלק אוכלוסייה splenocyte נמדדת באמצעות LSRII (BD Bioscience). תאים 32Dkit הם הראו פעילות גבוהות לעומת splenocytes נורמלי.

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry at JoVE.com

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

מאמר זה יפרט את הפרוטוקול למדידת פעילות calpain בתאים קבועים חי באמצעות cytometry הזרימה.

מדידת פעילות Calpain בתוך תאים חיים קבוע על ידי זרימת cytometry

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

בעקבות Cell-גורל ב<em&gt; א coli</em&gt; לאחר זיהום על ידי phage מבדה

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry

מדידה מצורף והפנמה של שפעת וירוס בתאי A549 על ידי cytometry הזרימה

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

מיון תא מופעל קרינה עבור טיהור של תאי דנדריטים Plasmacytoid ממח עצם העכבר

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

בידוד והתרבות במבחנה של מקרופאגים מכתשי מאתר ואנושי

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

הכנת מח עצם שלם לניתוח המוני Cy, לטיפול בניופיל-תאי השושלת

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

מדידת פאיגוציטוזה של אספרגייוס מחטאים מחט על ידי האדם לוקיולוציטים באמצעות זרם ציטוטוטרי

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are ...

Measuring Erythrocyte Complement Receptor 1 Using Flow Cytometry

מדידת קולטן אריתרופוציט 1 באמצעות שימוש בשיטת זרימה

CR1 (CD35, Complement Receptor type 1 for C3b/C4b) is a high molecular weight membrane glycoprotein of about 200 kDa that controls complement activation, ...

Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay

Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay

מדידת נוגדנים הרום Phagocytosis-באופן טבעי כדי Plasmodium falciparum טפילי על ידי אסאי מבוסס ציטומטריה זרימה

The protocol describes how to set up and run a flow cytometry-based phagocytosis assay of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes (IEs) opsonized by ...

Analysis of SAMHD1 Restriction by Flow Cytometry in Human Myeloid U937 Cells

ניתוח של הגבלת SAMHD1 על ידי ציטומטריה של זרימה בתאי מיאלואיד U937 אנושיים

Sterile &#945;-motif/histidine-aspartate domain-containing protein 1 (SAMHD1) inhibits replication of HIV-1 in quiescent myeloid cells. U937 cells are ...