Name: isolation, enrichment, and maintenance of medulloblastoma stem cells
Uploaded: 2010-09-01T17:00:00
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Cette étude a été soutenue par des subventions du Vanderbilt-Ingram Cancer Center Grant Support (P30 CA068485), la Fondation des tumeurs cérébrales enfance et les National Institutes of Health (NS042205).

1. Micro-dissection de la tumeur portant Cervelet, dissociation du tissu tumoral et placage <ol><li> Récupération de tissu tumoral <ol><li> Malade médulloblastome chez des souris porteuses sont souvent chétifs, affiché hydrocéphalie et typique des symptômes neurologiques, y compris paralysie des membres postérieurs et l&#39;incapacité à retrouver une posture en cas de retournement. Pour récupérer le tissu tumoral, euthanasier les souris par inhalation de dioxyde de carbone. Il est important de ne pas effec...

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	<li>Rossi, A., Caracciolo, V., Russo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medulloblastoma:+From+Molecular+Pathology+to+Therapy.">Medulloblastoma: From Molecular Pathology to Therapy.</a> Clin Cancer Res. 14 (4), 971-971 (2008).</li><li>Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+Neuronal+Precursor+Proliferation+in+the+Cerebellum+by+Sonic+Hedgehog.">Control of Neuronal Precursor Proliferation in the Cerebellum by Sonic Hedgehog.</a> P. Neuron. 22 (1), 103-103 (1999).</li><li>Dahmane, N., Ruiz, A., Altaba, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+regulates+the+growth+and+patterning+of+the+cerebellum.">Sonic hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum.</a> Development. 126 (14), 3089-3089 (1999).</li><li>Wallace, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purkinje-cell-derived+Sonic+hedgehog+regulates+granule+neuron+precursor+cell+proliferation+in+the+developing+mouse+cerebellum.">Purkinje-cell-derived Sonic hedgehog regulates granule neuron precursor cell proliferation in the developing mouse cerebellum.</a> Curr Biol. 9 (8), 445-445 (1999).</li><li>Fan, X., Eberhart, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medullablastoma+Stem+Cells.">Medullablastoma Stem Cells.</a> J Clin Oncol. 26 (17), 2821-2821 (2008).</li><li>Yoon, J. W., Gilbertson, R., Iannaccone, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+a+Role+for+Hedgehog+Pathway+Activation+in+Desmoplastic+Medulloblastoma+by+Identifying+GLI1+Target+Genes.+International+journal+of+cancer.">Defining a Role for Hedgehog Pathway Activation in Desmoplastic Medulloblastoma by Identifying GLI1 Target Genes. International journal of cancer.</a> 124 (1), 109-109 (2009).</li><li>O'Dorisio, M. S., Khanna, G., Bushnell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+anatomic+and+molecularly+targeted+imaging+in+the+diagnosis+and+surveillance+of+embryonal+tumors+of+the+nervous+and+endocrine+systems+in+children.+Review.">Combining anatomic and molecularly targeted imaging in the diagnosis and surveillance of embryonal tumors of the nervous and endocrine systems in children. Review.</a> Cancer metastasis reviews. 27 (4), 665-665 (2008).</li><li>Corcoran, R. B., Bachar Raveh, T., Barakat, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-like+Growth+Factor+2+Is+Required+for+Progression+to+Advanced+Medulloblastoma+in+patched1+Heterozygous+Mice.">Insulin-like Growth Factor 2 Is Required for Progression to Advanced Medulloblastoma in patched1 Heterozygous Mice.</a> Cancer research. 68 (21), 8788-8788 (2008).</li><li>Gilbertson, R. J., Ellison, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Origins+of+Medulloblastoma+Subtypes.">The Origins of Medulloblastoma Subtypes.</a> Annual review of pathology. 3, 341-341 (2008).</li><li>Ward, R. J., Lee, L., Graham, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotent+CD15++Cancer+Stem+Cells+in+Patched-1+Deficient+Mouse+Medulloblastoma.">Multipotent CD15+ Cancer Stem Cells in Patched-1 Deficient Mouse Medulloblastoma.</a> Cancer research. 69 (11), 4682-4682 (2009).</li><li>Mao, J., Ligon, K. L., Rakhlin, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Somatic+Mouse+Model+to+Survey+Tumorigenic+Potential+Applied+to+the+Hedgehog+Pathway.">A Novel Somatic Mouse Model to Survey Tumorigenic Potential Applied to the Hedgehog Pathway.</a> Cancer research. 66, 10171-10171 (2006).</li><li>Han, Y. G., Kim, H. J., Dlugosz, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+and+opposing+roles+of+primary+cilia+in+medulloblastoma+development.">Dual and opposing roles of primary cilia in medulloblastoma development.</a> Nature medicine. 15 (9), 1062-1062 (2009).</li></ol>

Nous décrivons une façon efficace d&#39;isoler, d&#39;enrichir et de maintenir les cellules souches du tissu médulloblastome tumeur primaire récupérées à partir des souris mutantes avec constitutivement active de signalisation Hedgehog. Nous avons constaté qu&#39;un étape critique dans la réussite d&#39;un lignée tumorale des cellules souches saines est le traitement utilisé pendant Accutase la dissociation du tissu tumoral primaire. Dans notre expérience, lors de la première tissu tumoral dissociant du ce...

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Neurobasal medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>21103049</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>hEGF</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>PHG0311</td>
<td>25ng/ml</td>
</tr>
<tr>
<td>bFGF</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>PHG0023</td>
<td>25ng/ml</td>
</tr>
<tr>
<td>N2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17502048</td>
<td>1X</td>
</tr>
<tr>
<td>B27(-RA)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>12587010</td>
<td>1X</td>
</tr>
<tr>
<td>Accutase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>A1110501</td>
<td>50%</td>
</tr>
<tr>
<td>Gelatin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G1393</td>
<td> 0.1%</td>
</tr>
<tr>
<td>Glutamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>25030081</td>
<td>2mM</td>
</tr>
<tr>
<td>Primaria dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>087724C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sox2 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>MAB4343</td>
<td>Mouse, 1:1000</td>
</tr>
<tr>
<td>Nestin antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>DSHB</td>
<td>rat401</td>
<td>Mouse, 1:200</td>
</tr>
<tr>
<td>YFP antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Probes</td>
<td>A11122</td>
<td>Rabbit, 1:2000</td>
</tr>
<tr>
<td>GFAP antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Neuromics</td>
<td>CH22102</td>
<td>Chicken, 1:1000</td>
</tr>
<tr>
<td>Tuj1 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T5076</td>
<td>Mouse, 1:2000</td>
</tr>
<tr>
<td>NeuN antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>MAB377</td>
<td>Mouse, 1:2000</td>
</tr>
<tr>
<td>CNPase antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>MAB326</td>
<td>Mouse, 1:1000</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

isolation, enrichment, and maintenance of medulloblastoma stem cells

Les tumeurs cérébrales ont été proposés à posséder une petite population de cellules souches qui sont à l&#39;origine de la tumorigenèse. Dosages Neurosphère ont été généralement adoptée pour étudier la nature des cellules souches neurales, y compris ceux issus de tissus normaux et tumoraux. Cependant, des quantités appréciables de différenciation et mort cellulaire sont communs dans neurosphères culture probablement en raison de sous-optimale état tels que l&#39;accessibilité de toutes les cellules dans les agrégats sphère au milieu de culture. Médulloblastome, la plus fréquente des tumeurs pédiatriques du SNC, est caractérisé par sa progression rapide et tendance à se propager le long de la totalité du cerveau-rachidien axe avec le résultat clinique lamentable. Le médulloblastome est une tumeur neuro-du cervelet, comptant pour 20% et 40% des tumeurs intracrâniennes et la fosse postérieure dans l&#39;enfance, respectivement 1. Il est maintenant bien établi que la signalisation de Shh stimule la prolifération des précurseurs de neurones du cervelet granules (CGNPs) pendant le développement du cervelet 2-4. De nombreuses études utilisant des modèles de souris, dans lequel la voie Shh est constitutivement activé, ont lié la signalisation de Shh avec médulloblastome 5-9. Un récent rapport a montré que sous-ensemble de cellules provenant de souris médulloblastome LacZ Patched1 / + sont des cellules souches cancéreuses, qui sont capables d&#39;initier et propogating tumeurs 10. Nous décrivons ici une méthode efficace pour isoler, d&#39;enrichir et de maintenir les cellules souches tumorales dérivées de plusieurs modèles murins de médulloblastome, avec voie Shh constitutivement activé en raison d&#39;une mutation dans Smoothened (11, Héraion mentionné que SmoM2), un RCPG qui est essentiel pour Shh activation de la voie. Dans tous les tissus médulloblastome isolés, nous avons été en mesure d&#39;établir de nombreuses colonies très prolifératives. Ces cellules robuste exprimé plusieurs marqueurs des cellules souches neurales telles que Nestin et Sox2, peuvent subir des passages en série (plus de 20) et ont été clonogénique. Bien que ces cellules souches tumorales en culture ont été relativement faibles, souvent avec des armes nucléaires bipoar élevé par rapport au cytoplasme lorsqu&#39;elles sont cultivées dans des conditions favorisant la croissance des cellules souches, ils radicalement modifié leur morphologie, prolongée de plusieurs processus cellulaires, aplatie et se retire du cycle cellulaire lors de la commutation d&#39;une cellule milieu de culture supplémenté avec 10% de sérum de veau foetal. Plus important encore, ces cellules souches tumorales différenciées en Tuj1 + ou + NeuN neurones, les astrocytes et GFAP + + CNPase oligodendrocytes, soulignant ainsi leur multi-puissance. En outre, ces cellules ont été capables de propager des médulloblastomes secondaire lorsque orthotopique transplantées chez des souris hôte.

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Isolation, Enrichment, and Maintenance of Medulloblastoma Stem Cells

Ce protocole décrit l&#39;isolement, l&#39;enrichissement et l&#39;entretien des cellules tumorales médulloblastome souches dérivées de souris mutantes avec ectopique Sonic activité de la voie Hedgehog.

L&#39;isolement, l&#39;enrichissement et l&#39;entretien des cellules souches Médulloblastome

Brain tumors have been suggested to possess a small population of stem cells that are the root cause of tumorigenesis. Neurosphere assays have been ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Intracranial Orthotopic Allografting of Medulloblastoma Cells in Immunocompromised Mice

Intracrânienne allogreffe orthotopique de cellules dans des souris immunodéprimées Médulloblastome

Medulloblastoma is the most common pediatric tumor of the nervous system. A large body of animal studies has focused on cerebellar granule neuron ...

Recherche

Neurosciences

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L&#39;isolement et expansion des cellules souches neurales de souris adultes utilisant le test Neurosphère

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Isolement, Culture et maintenance à long terme des mésencéphalique primaire dopaminergiques neurones à partir de cerveaux embryonnaires de rongeurs

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