Name: multicolor time-lapse imaging of transgenic zebrafish: visualizing retinal stem cells activated by targeted neuronal cell ablation
Uploaded: 2010-09-20T17:00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multicolor Time-lapse Imaging of Transgenic Zebrafish: Visualizing Retinal Stem Cells Activated by Targeted Neuronal Cell Ablation at JoVE.com

We willen Drs bedanken. Meera Saxena en Jonathan Mathias voor nuttige commentaar op het manuscript. Wij danken Drs. Michael Parsons, Pamela Raymond, en Rachel Wong voor het leveren van transgene lijnen. Experimenten op dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en voorschriften uiteengezet door de MCG IACUC set goedgekeurde protocol 07-12-003 * B. Dit werk werd ondersteund door NIH R21 MH083614 en een March of Dimes Basil O Conner Starter Scholar Award uit aan JSM

<ol>
	<li>K&#246;ster, R. W., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+microscopy+of+brain+development.">Time-lapse microscopy of brain development.</a> Methods Cell Biol. 76, 207-235 (2004).</li><li>Mumm, J. S., Williams, P. R., Godinho, L., Koerber, A., Pittman, A. J., Roeser, T., Chien, C. B., Baier, H., Wong, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+reveals+dendritic+targeting+of+laminated+afferents+by+zebrafish+retinal+ganglion+cells.">In vivo imaging reveals dendritic targeting of laminated afferents by zebrafish retinal ganglion cells.</a> Neuron. 52, 609-621 (2006).</li><li>Curado, S., Anderson, R. M., Jungblut, B., Mumm, J., Schroeter, E., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+targeted+cell+ablation+in+zebrafish:+a+new+tool+for+regeneration+studies.">Conditional targeted cell ablation in zebrafish: a new tool for regeneration studies.</a> Dev Dyn. 236, 1025-1035 (2007).</li><li>Ren, J. Q., McCarthy, W. R., Zhang, H., Adolph, A. R., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+visual+responses+of+wild-type+and+hypopigmented+zebrafish.">Behavioral visual responses of wild-type and hypopigmented zebrafish.</a> Vision Res. 42, 293-299 (2002).</li><li>Pisharath, H., Rhee, J. M., Swanson, M. A., Leach, S. D., Parsons, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+ablation+of+beta+cells+in+the+embryonic+zebrafish+pancreas+using+E.+Coli+nitroreductase.">Targeted ablation of beta cells in the embryonic zebrafish pancreas using E. Coli nitroreductase.</a> Mech Dev. 124, 218-229 (2007).</li><li>Andersen, E., Asuri, N., Clay, M., Halloran, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> J Vis Exp. , (2010).</li><li>O'Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+axotomy+and+time-lapse+confocal+imaging+in+live+zebrafish+embryos.">Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Graeden, E., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> J Vis Exp. , (2009).</li></ol>

JSM is bekroond met een patent op het gebruik van de nitroreductase-gebaseerde systeem van de cel ablatie in zebravis (Mumm JS, en Schroeter, EH Gerichte en regionale Ablation Cellular Ablation in de zebravis &quot;US Patent 7,514,595. 07 april 2009). Deze techniek is gebruikt als algemeen platform voor een tools en services biotechnologisch bedrijf, Luminomics, Inc, dat JSM opgericht en blijft een stakeholder inch

In deze video, is een overzicht van de technieken die we gebruiken voor multicolor confocale time-lapse imaging en gerichte cel ablatie verstrekt. Wij gebruiken time-lapse imaging om het gedrag van meerdere celtypen van interesse in vivo monitor, terwijl de gerichte cel ablatie wordt gebruikt om de neurale circuit functie en cel-specifieke neuronale regeneratie paradigma&#39;s te bestuderen. De getoonde voorbeelden benadrukken diverse voordelen die kunnen worden afgeleid uit deze benaderingen. Misschien wel het meest belangrijke, time-lapse imaging biedt een intern gecontroleerde paradigma, waargenomen alle verschijnselen kunnen worden gerelateerd aan de vorige staten. Dit maakt directe in plaats van afgeleid vergelijkingen te maken tussen experimenteel tijdstippen, waardoor de relatieve veranderingen makkelijker te kwantificeren en het verminderen van experimentele &#39;ruis&#39; geassocieerd met variaties binnen een populatie. Een voordeel van multicolor beeldvorming is de mogelijkheid om veranderingen in de interactie en / of de naburige celtypen te visualiseren. Bijvoorbeeld, het gebruik van een transgene lijn die Müller glia labels, zijn we nu het karakteriseren van de respons van deze potentiële verwonding veroorzaakte stamcellen om het verlies van discrete netvlies cel subpopulaties. We hebben ook gebruik gemaakt van deze aanpak om nieuwe mechanismen van neurale circuit de vorming 2 te definiëren. Tot slot, in aanvulling op studies van cellulaire regeneratie, hebben we onlangs begonnen met het gebruik van de NTR-based ablatie systeem om de functionele rol van neuronale subtypes dus discrete neurale circuits met behulp van verschillende paradigma&#39;s gedragsmatige en elektrofysiologische testen te onderzoeken. Het unieke voordeel van de tewerkstelling van de zebravis voor dergelijke studies is dat te wijten aan hun regeneratievermogen, veroorzaakte tekorten tijdelijk zijn. Dus, door correleren met time-lapse imaging assays kunnen we typeren reïnnervatie mechanismen die leiden tot, evenals de mate van reïnnervatie nodig is voor, functioneel herstel. Op voorwaarde dat de methoden kunnen worden aangepast aan de vele verschillende vragen. Bijvoorbeeld, kunnen vergelijkbare analyses van ablatie en regeneratie worden toegepast op elke transgenically definieerbare cellulaire subtype. Gezamenlijk worden deze studies hebben het potentieel om ons begrip van de regeneratie uit te breiden op het niveau van de individuele celtypen en binnen de discrete stamcellen niches.

1. Reagentia: Danieau&#39;s oplossing: <ul><li> natriumchloride (Fisher, S271 1) </li><li> kaliumchloride (Fisher, P217 500) </li><li> HEPES (Fisher, BP310500) </li><li> magnesiumsulfaat (Fisher, M65 500) </li><li> calciumnitraat (Fisher, C109500) </li><li> Penicilline-streptomycine (Fisher, ICN1670049) </li></ul> Andere reagentia: <ul><li> Lage smelt agarose (Fisher, BP165-25) </li><li> Tricane methaansulfonaat (Fisher, NC9435281) </li><li> N-phenylthiourea (Fisher, NC9968868) </li><li> Metronidazol (Fisher, AC21034-1000) </li></ul> 2. Benodigdheden: <ul><li> Diep petri-schalen (Fisher Scientific / Corning, 08-772-32) </li><li> Dumont # 5 fijn pincet (Fisher, NC9404145) </li></ul> 3. Uitrusting: <ul><li> Zoom Stereoscope (Olympus, SZ51) </li><li> Fluorescentie Zoom Stereoscope (Olympus, SZX16) </li><li> Confocale microscoop (Olympus FV1000) </li><li> Digitale blokverwarming - Isotemp (Fisher, 11-715-125DQ) </li><li> Barnstead / Thermolyne Benchtop Incubator (Fisher, 11-702-4). </li></ul>

multicolor time-lapse imaging of transgenic zebrafish: visualizing retinal stem cells activated by targeted neuronal cell ablation

Hoge-resolutie time-lapse imaging van levende zebravis larven kan worden gebruikt om te visualiseren hoe biologische processen ontvouwen (voor review zie 1). Samengestelde transgene vis die verschillende fluorescerende verslaggevers te uiten in de ons omringende celtypen een middel van het volgen van cellulaire interacties 2 en / of weefsel-level reacties op experimentele manipulaties in de tijd. In deze video, tonen we aan methoden die gebruikt kunnen worden serieel voor beeldvorming meerdere transgenically gelabeld celtypes in de individuele vissen na verloop van tijd cursussen die kunnen variëren van minuten tot enkele dagen. De beschreven technieken zijn van toepassing op een studie die aan het &quot;gedrag&quot; van de naburige cellen types correleren loop van de tijd, zoals: &#39;catch and release&#39; 1) seriële methode voor het afbeelden van een groot aantal vissen over opeenvolgende dagen, 2) in vereenvoudigde methoden voor het scheiden van fluoroforen met overlappende excitatie / emissie profielen (bijvoorbeeld GFP en YFP), 3) het gebruik van hypopigmented mutant lijnen uit te breiden het tijdvenster beschikbaar is voor hoge-resolutie beeldvorming in de late larvale stadia van ontwikkeling, 4) het gebruik van membraan gerichte fluorescente reporters om te onthullen fijne morfologische detail van individuele cellen als cellulaire details in grotere populaties van cellen, en 5) een eerder beschreven methode voor chemisch-geïnduceerde ablatie van transgenically gerichte celtypen, dat wil zeggen, nitroreductase (NTR) gemedieerde omzetting van prodrug substraten, zoals metronidazol (MTZ), voor cytotoxische derivaten 3,5. Als voorbeeld van deze benaderingen, zullen we visualiseren de ablatie en de regeneratie van een subtype van het netvlies bipolaire neuron in de individuele vissen over meerdere dagen. Tegelijkertijd zullen we monitoren een aantal andere retinale celtypen, waaronder naburige niet-gerichte bipolaire cellen en mogelijke degeneratie-gestimuleerde het netvlies stamcellen (dat wil zeggen, Mϋller glia). Deze strategie wordt toegepast in ons lab tot cel-en weefsel-niveau (bijvoorbeeld stamcel niche) reacties karakteriseren aan de selectieve verlies en regeneratie van gerichte neuronale celtypen.

Watch this Scientific Journal Video about Multicolor Time-lapse Imaging of Transgenic Zebrafish: Visualizing Retinal Stem Cells Activated by Targeted Neuronal Cell Ablation at JoVE.com

Multicolor Time-lapse Imaging of Transgenic Zebrafish: Visualizing Retinal Stem Cells Activated by Targeted Neuronal Cell Ablation

In deze video worden de technieken voor multicolor confocale time-lapse imaging en gerichte cel ablatie verstrekt. Time-lapse imaging wordt gebruikt om het gedrag van meerdere celtypen van belang te volgen<em&gt; In vivo</em&gt;. Gerichte cel ablatie vergemakkelijkt de studie neurale circuit functie en cel-specifieke neuronale regeneratie paradigma&#39;s.

Multicolor Time-lapse imaging van transgene zebravis: Visualizing netvlies Stem Cells geactiveerd door middel van gerichte neuronale cellen Ablation

High-resolution time-lapse imaging of living zebrafish larvae can be utilized to visualize how biological processes unfold (for review see 1). Compound ...

Research

JoVE Journal

Biology

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Transplantatie van Whole nier Marrow in Adult zebravis

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

Afleiding van menselijke embryonale stamcellen door Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Twee-foton axotomy en time-lapse confocale imaging in levende zebravis embryo&#39;s

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Generation of Human CD40-activated B cells

Generatie van de Mens CD40-geactiveerde B-cellen

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

Tissue Targeted Embryonic Chimeras: Zebrafish Gastrula Cell Transplantation

Tissue Gerichte Embryonale Chimera: Zebravis gastrula Cell Transplantation

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Time-lapse Imaging van mitose Na siRNA transfectie

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Lot in kaart brengen van menselijke embryonale stamcellen door teratoom Formation

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three ...

Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy

Visualisatie van craniofaciale ontwikkeling in de SOX10: kaede transgene zebravis Line Met behulp van Time-lapse confocale microscopie

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-dimensionale Tracking van hematopoietische stamcellen en progenitorcellen in volwassen muis calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Generatie van transgene<em&gt; Hydra</em&gt; Door Embryo Microinjection

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among ...