Name: multicolor time-lapse imaging of transgenic zebrafish: visualizing retinal stem cells activated by targeted neuronal cell ablation
Uploaded: 2010-09-20T17:00:00
Duration: 10 min 31 s
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Desideriamo ringraziare Drs. Meera Saxena e Jonathan Mathias per gli utili commenti sul manoscritto. Ringraziamo Drs. Michael Parsons, Pamela Raymond, e Rachel Wong per la fornitura di linee transgeniche. Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e dei regolamenti previsti dal protocollo approvato IACUC MCG 07-12-003 * B. Questo lavoro è stato sostenuto da NIH R21 MH083614 e March of Dimes Basilio Scholar Award O Conner Starter per JSM

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	<li>K&#246;ster, R. W., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+microscopy+of+brain+development.">Time-lapse microscopy of brain development.</a> Methods Cell Biol. 76, 207-235 (2004).</li><li>Mumm, J. S., Williams, P. R., Godinho, L., Koerber, A., Pittman, A. J., Roeser, T., Chien, C. B., Baier, H., Wong, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+reveals+dendritic+targeting+of+laminated+afferents+by+zebrafish+retinal+ganglion+cells.">In vivo imaging reveals dendritic targeting of laminated afferents by zebrafish retinal ganglion cells.</a> Neuron. 52, 609-621 (2006).</li><li>Curado, S., Anderson, R. M., Jungblut, B., Mumm, J., Schroeter, E., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+targeted+cell+ablation+in+zebrafish:+a+new+tool+for+regeneration+studies.">Conditional targeted cell ablation in zebrafish: a new tool for regeneration studies.</a> Dev Dyn. 236, 1025-1035 (2007).</li><li>Ren, J. Q., McCarthy, W. R., Zhang, H., Adolph, A. R., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+visual+responses+of+wild-type+and+hypopigmented+zebrafish.">Behavioral visual responses of wild-type and hypopigmented zebrafish.</a> Vision Res. 42, 293-299 (2002).</li><li>Pisharath, H., Rhee, J. M., Swanson, M. A., Leach, S. D., Parsons, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+ablation+of+beta+cells+in+the+embryonic+zebrafish+pancreas+using+E.+Coli+nitroreductase.">Targeted ablation of beta cells in the embryonic zebrafish pancreas using E. Coli nitroreductase.</a> Mech Dev. 124, 218-229 (2007).</li><li>Andersen, E., Asuri, N., Clay, M., Halloran, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> J Vis Exp. , (2010).</li><li>O'Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+axotomy+and+time-lapse+confocal+imaging+in+live+zebrafish+embryos.">Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Graeden, E., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> J Vis Exp. , (2009).</li></ol>

JSM ha ottenuto un brevetto sull&#39;utilizzo della nitroreductase sistema basato su di ablazione delle cellule in zebrafish (Mumm JS, e Schroeter, EH ablazione ablazione mirata e regionali cellulare in Zebrafish &quot;US Patent 7514595. 7 aprile 2009). Questa tecnica è utilizzato come piattaforma generale per una serie di strumenti e della biotecnologia società di servizi, Luminomics, Inc., che JSM fondato e rimane una delle parti interessate in

In questo video, una panoramica delle tecniche che usiamo per multicolore confocale time-lapse imaging e l&#39;ablazione delle cellule bersaglio è fornito. Ci avvaliamo di time-lapse imaging per monitorare il comportamento dei diversi tipi di cellule di interesse in vivo, mentre l&#39;ablazione delle cellule bersaglio viene utilizzato per studiare la funzione del circuito e delle cellule neuronali specifici paradigmi rigenerazione neuronale. Gli esempi riportati evidenziano diversi vantaggi che possono essere raccolte da questi approcci. Forse più significativa, time-lapse imaging fornisce un paradigma internamente controllata; fenomeni qualsiasi osservati possono essere legati a stati di nuovo precedenti. Questo permette un confronto diretto, piuttosto che dedurre da effettuare attraverso punti di tempo sperimentali, apportando modifiche relativamente facile da quantificare e riducendo sperimentale &#39;rumore&#39; associata a variazioni all&#39;interno di una popolazione. Un vantaggio di immagine multicolore è la capacità di visualizzare le modifiche ad interagire e / o tipi di cellule vicine. Ad esempio, utilizzando una linea transgenica che le etichette glia Müller, siamo ora che caratterizzano la risposta di questi potenziali lesioni indotte da cellule staminali per la perdita di discreto sottopopolazioni di cellule della retina. Abbiamo anche usato questo metodo per definire nuovi meccanismi di formazione del circuito neurale 2. Infine, oltre agli studi di rigenerazione cellulare, abbiamo recentemente iniziato a utilizzare il NTR sistema basato ablazione per indagare il ruolo funzionale dei sottotipi neuronali così i circuiti neurali separati utilizzando diversi paradigmi comportamentali e analisi elettrofisiologiche. Il vantaggio unico di impiegare il pesce zebra per tali studi è che, grazie alla loro capacità rigenerativa, i deficit indotti sono temporanee. Così, da correlare con time-lapse analisi di immagini si possono caratterizzare i meccanismi che portano alla reinnervazione, così come il grado di reinnervazione necessari per il recupero funzionale. Le modalità previste può essere adattato a molte domande differenti. Per esempio, analisi simili di ablazione e di rigenerazione può essere applicato a qualsiasi sottotipo transgenically definibile cellulare. Collettivamente, questi studi hanno un potenziale di espandere la nostra comprensione della rigenerazione a livello di tipi di cellule individuali ed entro nicchie discrete cellule staminali.

1. Reagenti: Soluzione Danieau di: <ul><li> cloruro di sodio (Fisher, S271 1) </li><li> cloruro di potassio (Fisher, P217 500) </li><li> HEPES (Fisher, BP310500) </li><li> solfato di magnesio (Fisher, M65 500) </li><li> nitrato di calcio (Fisher, C109500) </li><li> Penicillina-streptomicina (Fisher, ICN1670049) </li></ul> Altri reagenti: <ul><li> Bassa temperatura di fusione agarosio (Fisher, BP165-25) </li><li> Tricane metanosolfonato (Fisher, NC9435281) </li><li> N-phenylthiourea (Fisher, NC9968868) </li><li> Metronidazolo (Fisher, AC21034-1000) </li></ul> 2. Forniture: <ul><li> Profonda petri-piatti (Fisher Scientific / Corning, 08-772-32) </li><li> Dumont # 5 pinza sottile (Fisher, NC9404145) </li></ul> 3. Attrezzatura: <ul><li> Zoom stereoscopio (Olympus, SZ51) </li><li> Fluorescenza stereoscopio Zoom (Olympus, SZX16) </li><li> Microscopio confocale (Olympus FV1000) </li><li> Digital riscaldamento blocco - Isotemp (Fisher, 11-715-125DQ) </li><li> Barnstead / Thermolyne Incubatore da banco (Fisher, 11-702-4). </li></ul>

multicolor time-lapse imaging of transgenic zebrafish: visualizing retinal stem cells activated by targeted neuronal cell ablation

Ad alta risoluzione time-lapse imaging di larve di zebrafish vivente può essere utilizzato per visualizzare come i processi biologici si svolgono (per una rassegna vedi 1). Pesce composto transgenici che esprimono diversi reporter fluorescente in tipi di cellule vicine fornire un mezzo di seguire interazioni cellulari 2 e / o tessuto risposte a livello di manipolazioni sperimentali nel corso del tempo. In questo video, dimostriamo metodi che possono essere utilizzati per l&#39;imaging più tipi di cellule transgenically etichettati serialmente nel pesce singoli corsi nel tempo che può estendersi da pochi minuti a diversi giorni. Le tecniche descritte sono applicabili a qualsiasi studio cercando di correlare il &quot;comportamento&quot; della vicina tipi di cellule nel tempo, tra cui: &#39;catch and release&#39; 1) seriale metodi per l&#39;imaging di un gran numero di pesci più giorni consecutivi, 2) metodi semplificati per la separazione fluorofori con sovrapposizione di eccitazione / emissione di profili (ad esempio, GFP e YFP), 3) uso di ipopigmentate linee mutanti di estendere la finestra temporale a disposizione per imaging ad alta risoluzione in ritardo stadi larvali di sviluppo, 4) uso di membrane mirato reporter fluorescente per rivelare multa dettaglio morfologico delle singole cellule così come i dettagli cellulari in grandi popolazioni di cellule, e 5) un metodo precedentemente descritto per chimicamente indotte ablazione di tipi di cellule transgenically mirata, cioè, nitroreductase (NTR) conversione mediata di substrati profarmaco, come il metronidazolo (MTZ), ai derivati ​​citotossici 3,5. Come esempio di questi approcci, si visualizzerà l&#39;ablazione e la rigenerazione di un sottotipo di retina bipolare neurone all&#39;interno di singoli pesci più giorni. Contemporaneamente ci sarà monitorare diversi altri tipi di cellule della retina, compreso vicini e non mirato le cellule bipolari e il potenziale degenerazione stimolate le cellule staminali della retina (ad esempio, glia Mϋller). Questa strategia viene applicata nel nostro laboratorio per la caratterizzazione delle cellule e dei tessuti a livello (ad esempio, di nicchia delle cellule staminali) risposte alla perdita selettiva e la rigenerazione di mirati tipi di cellule neuronali.

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Multicolor Time-lapse Imaging of Transgenic Zebrafish: Visualizing Retinal Stem Cells Activated by Targeted Neuronal Cell Ablation

In questo video, le tecniche per multicolor confocale time-lapse imaging e ablazione delle cellule bersaglio sono forniti. Time-lapse imaging è utilizzato per monitorare il comportamento dei diversi tipi di cellule di interesse<em&gt; In vivo</em&gt;. L&#39;ablazione delle cellule bersaglio facilita il circuito neurale funzione di studio e cellule specifici paradigmi rigenerazione neuronale.

Multicolor time-lapse imaging di transgenici Zebrafish: Visualizzare cellule staminali della retina Attivato da mirata ablazione delle cellule neuronali

High-resolution time-lapse imaging of living zebrafish larvae can be utilized to visualize how biological processes unfold (for review see 1). Compound ...

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