Name: bacterial delivery of rnai effectors: transkingdom rnai
Uploaded: 2010-08-18T17:00:00
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Les travaux ont été soutenus par des subventions non. 01GU0615 du «Bundesministerium für Forschung und Technologie (BMBF).

1) Livraison bactérienne des shRNA <ol><li> Avant de commencer avec la culture bactérienne, il faut se préparer milieu LB et LB-agar. </li><li> Pour le milieu LB peser extrait de levure (0,5% p / v), Bacto tryptone (1,0% p / v), et du NaCl (0,6% p / v) et diluer ces composants dans de l&#39;eau bidest. Les solutions préparées doivent être stérilisés dans un autoclave et sont alors prêtes à utiliser. </li><li> Pour LB-agar gélose Bacto (1,5% p / v) doit être ajoutée à la précédente milieu LB à la stér...

<ol>
	<li>Kr&#252;hn, A., Wang, A., Fruehauf, J. H., Lage, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+short+hairpin+RNAs+by+transkingdom+RNA+interference+modulates+the+classical+ABCB1-mediated+multidrug-resistant+phenotype+of+cancer+cells.">Delivery of short hairpin RNAs by transkingdom RNA interference modulates the classical ABCB1-mediated multidrug-resistant phenotype of cancer cells.</a> Cell Cycle. 8, 3349-3354 (2009).</li><li>Lage, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MDR1/P-glycoprotein+(ABCB1)+as+target+for+RNA+interference-mediated+reversal+of+multidrug+resistance.">MDR1/P-glycoprotein (ABCB1) as target for RNA interference-mediated reversal of multidrug resistance.</a> Curr. Drug Targets. 7, 813-821 (2006).</li><li>Lage, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+cancer+multidrug+resistance:+a+still+unsolved+problem.">An overview of cancer multidrug resistance: a still unsolved problem.</a> Cell. Mol. Life Sci. 65, 3145-3167 (2008).</li><li>Lage, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+potential+of+RNA+interference+in+drug-resistant+cancers.">Therapeutic potential of RNA interference in drug-resistant cancers.</a> Fut. Oncol. 5, 169-185 (2009).</li><li>Nguyen, T. A., Fruehauf, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transkingdom+RNA+interference+(tkRNAi):+a+novel+method+to+induce+therapeutic+gene+silencing.">Transkingdom RNA interference (tkRNAi): a novel method to induce therapeutic gene silencing.</a> Methods Mol. Biol. 514, 27-34 (2009).</li><li>Nieth, C., Priebsch, A., Stege, A., Lage, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+the+classical+multidrug+resistance+(MDR)+phenotype+by+RNA+interference+(RNAi.">Modulation of the classical multidrug resistance (MDR) phenotype by RNA interference (RNAi.</a> FEBS Lett. 545, 144-150 (2003).</li><li>Stege, A., Priebsch, A., Nieth, C., Lage, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+and+complete+overcoming+of+MDR1/P-glycoprotein-mediated+multidrug+resistance+in+human+gastric+carcinoma+cells+by+RNA+interference.">Stable and complete overcoming of MDR1/P-glycoprotein-mediated multidrug resistance in human gastric carcinoma cells by RNA interference.</a> Cancer Gene Ther. 11, 699-706 (2004).</li><li>Stein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+in+vivo+reversal+of+the+multidrug+resistance+(MDR)+phenotype+by+jet-injection+of+anti-MDR1+short+hairpin+RNA-encoding+plasmid+DNA.">Complete in vivo reversal of the multidrug resistance (MDR) phenotype by jet-injection of anti-MDR1 short hairpin RNA-encoding plasmid DNA.</a> Mol. Ther. 16, 178-186 (2008).</li><li>Xiang, S., Fruehauf, J., Li, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+hairpin+RNA-expressing+bacteria+elicit+RNA+interference+in+mammals.">Short hairpin RNA-expressing bacteria elicit RNA interference in mammals.</a> Nat. Biotechnol. 24, 697-702 (2006).</li></ol>

Le nombre de cellules ensemencées pour l&#39;infection et la MOI correspondants utilisés, dépendent essentiellement sur les lignées cellulaires sous observation et leur vitesse de croissance. Pour trouver le nombre de cellules optimales pour le semis, pré-expériences pour déterminer la vitesse de croissance sont fortement recommandées. Outre cela, IAM de différents doivent être testés en raison de la limite d&#39;étendre à laquelle les cellules peuvent se l&#39;invasion bactérienne sans mourir de stress. L...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Agar</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biochrom AG</td>
<td>214050</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Amphotericin B</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biochrom AG</td>
<td>A2612</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline-PBS (10 x)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen GmbH</td>
<td>14080048</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>E. coli ceq221</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cequent Pharmaceuticals Inc.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>No catalogue available, direct order</td>
</tr>
<tr>
<td>Gentamycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biochrom AG</td>
<td>A2710</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin/Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen GmbH</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Contains 5,000 units of penicillin (base) and 5,000 &mu;g of streptomycin (base)/ml utilizing penicillin G (sodium salt) and streptomycin sulfate in 0.85% saline.</td>
</tr>
<tr>
<td>Sodium chloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Merck KgaA</td>
<td>1064060500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tryptone</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco Laboratories</td>
<td>211705</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Yeast Extract</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco Laboratories</td>
<td>212750</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

bacterial delivery of rnai effectors: transkingdom rnai

L&#39;interférence ARN (ARNi) représente un mécanisme de haute efficace pour l&#39;inhibition spécifique de l&#39;expression de l&#39;ARNm. Outre son potentiel comme outil de laboratoire puissant, la voie de l&#39;ARNi semble être prometteuse pour l&#39;utilisation thérapeutique. Pour le développement de l&#39;interférence ARN (ARNi) basé sur les thérapies, la livraison de l&#39;ARNi médiation des agents à des cellules cibles est l&#39;un des obstacles majeurs. Une nouvelle stratégie pour surmonter cet obstacle est transkingdom ARNi (tk ARNi). Cette technologie utilise des bactéries non pathogènes, par exemple, Escherichia coli, pour produire et livrer en épingle à cheveux courts ARN thérapeutiques (shRNA) dans les cellules cibles pour induire l&#39;ARNi. Une première génération tk ARNi médiation vecteur, TRIP, contient le promoteur du bactériophage T7 pour régulation de l&#39;expression d&#39;un shRNA thérapeutiques d&#39;intérêt. Par ailleurs, TRIP a le locus Inv partir de Yersinia pseudotuberculosis qui encode invasine, qui permet naturelle des bactéries non invasives d&#39;entrer β1-intégrine-positif cellules de mammifères et le gène HlyA partir de la bactérie Listeria monocytogenes, qui produit listériolysine O. Cet enzyme permet le shRNA thérapeutiques pour échapper à d&#39;entrée des vésicules dans le cytoplasme de la cellule cible. Construit TRIP sont introduits dans une compétents souche non pathogène Escherichia coli, qui code T7 RNA polymérase nécessaire à l&#39;promoteur T7 axée synthèse de shRNA. Une molécule cible bien caractérisé associée au cancer pour les stratégies de RNAi différents ABCB1 (MDR1/P-glycoprotein, MDR1/P-gp). Ce ABC-transporteur agit comme une pompe d&#39;extrusion de drogue et médiatise la &quot;classique&quot; multirésistance ABCB1 médiation (MDR) phénotype des cellules cancéreuses humaines qui se caractérise par un profil de résistance croisée spécifique. ABCB1 exprimant différentes cellules cancéreuses ont été MDR traités par anti-ABCB1 shRNA vecteur d&#39;expression portant E. coli. Cette procédure a abouti à l&#39;activation des voies de l&#39;ARNi dans les cellules cancéreuses et une réglementation considérable bas de l&#39;ARNm de ABCB1 encodage ainsi que la pompe d&#39;extrusion médicament correspondant. En conséquence, l&#39;accumulation du médicament a été renforcée dans les cellules du cancer primitif résistantes aux médicaments et le phénotype MDR a été inversé. Au moyen de ce modèle les données fournissent la preuve de concept que les savoirs traditionnels ARNi est adapté à la modulation de cancer associés à des facteurs, par exemple ABCB1 dans des cellules cancéreuses humaines.

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Bacterial Delivery of RNAi Effectors: Transkingdom RNAi

Pour le développement de l&#39;interférence ARN (ARNi) thérapies basées sur une nouvelle stratégie a été développée, transkingdom ARNi (tkRNAi). Cette technologie utilise des bactéries non pathogènes pour produire et livrer en épingle à cheveux courts ARN thérapeutiques (shRNA) dans les cellules cibles. Ici, tkRNAi a été appliquée avec succès pour le renversement de la multirésistance classique ABCB1 médiation (MDR) des cellules cancéreuses.

Livraison bactérienne de l&#39;ARNi Effectors: Transkingdom ARNi

RNA interference (RNAi) represents a high effective mechanism for specific inhibition of mRNA expression. Besides its potential as a powerful laboratory ...

Research

JoVE Journal

Biology

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A. gambiae)

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes A. gambiae

Protocole pour des essais de l&#39;ARNi dans les moustiques adultes (A. gambiae)

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video ...

Recherche

Biologie

Localized RNAi and Ectopic Gene Expression in the Medicinal Leech

Localisé ARNi et l&#39;expression des gènes extra-utérine dans la sangsue médicinale

In this video, we show the use of a pneumatic capillary gun for the accurate biolistic delivery of reagents into live tissue. We use the procedure to ...

Identification of Growth Inhibition Phenotypes Induced by Expression of Bacterial Type III Effectors in Yeast

Identification des phénotypes inhibition de la croissance induite par l&#39;expression de bactéries de type III Effectors dans la levure

Many Gram-negative pathogenic bacteria use a type III secretion system to translocate a suite of effector proteins into the cytosol of host cells. Within ...

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

EsiRNA MISSION pour le dépistage de l&#39;ARNi dans les cellules de mammifères

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

Interférences ARNi par injection dans les ARNdb Drosophile Embryons

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements ...

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

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ARNi Mediated inactivation génique et la transgénèse par microinjection dans le nématode Necromenic Pristionchus pacificus</em

Although it is increasingly affordable for emerging model organisms to obtain completely sequenced genomes, further in-depth gene function and expression ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

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Dépistage ARNi pour identifier les phénotypes postembryonnaires dans C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

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Quantitatifs et automatisé à haut débit du génome à l&#39;échelle écrans ARNi dans C. elegans</em

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. ...

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

Inactivation génique médiée par ARNi et<em&gt; In Vivo</emEssai diurèse&gt; Femmes adultes<em&gt; Aedes aegypti</em&gt; Les moustiques

This video protocol demonstrates an effective technique to knockdown a particular gene in an insect and conduct a novel bioassay to measure excretion ...

Phosphopeptide Analysis of Rodent Epididymal Spermatozoa

Phosphopeptide Analyse des rongeurs spermatozoïdes épididymaires

Spermatozoa are quite unique amongst cell types. Although produced in the testis, both nuclear gene transcription and translation are switched off once ...