Name: bacterial delivery of rnai effectors: transkingdom rnai
Uploaded: 2010-08-18T17:00:00
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Trabalho foi financiado por bolsa nenhuma. 01GU0615 do &quot;Bundesministerium für Forschung und Technologie (BMBF).

1) Entrega bacteriana da shRNAs <ol><li> Antes de iniciar com a cultura bacteriana, um tem que se preparar LB médio e LB-ágar. </li><li> Para o LB médio pesar extrato de levedura (0,5% w / v), Bacto triptona (1,0% w / v) e NaCl (0,6% w / v) e diluir estes componentes em água bidest. As soluções preparadas têm que ser esterilizados em autoclave e são, então, pronto para uso. </li><li> Para LB-agar agar Bacto placas (1,5% w / v) tem de ser adicionado à LB médio anteriores à esterilização. </li><li> Aquecer...

<ol>
	<li>Kr&#252;hn, A., Wang, A., Fruehauf, J. H., Lage, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+short+hairpin+RNAs+by+transkingdom+RNA+interference+modulates+the+classical+ABCB1-mediated+multidrug-resistant+phenotype+of+cancer+cells.">Delivery of short hairpin RNAs by transkingdom RNA interference modulates the classical ABCB1-mediated multidrug-resistant phenotype of cancer cells.</a> Cell Cycle. 8, 3349-3354 (2009).</li><li>Lage, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MDR1/P-glycoprotein+(ABCB1)+as+target+for+RNA+interference-mediated+reversal+of+multidrug+resistance.">MDR1/P-glycoprotein (ABCB1) as target for RNA interference-mediated reversal of multidrug resistance.</a> Curr. Drug Targets. 7, 813-821 (2006).</li><li>Lage, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+cancer+multidrug+resistance:+a+still+unsolved+problem.">An overview of cancer multidrug resistance: a still unsolved problem.</a> Cell. Mol. Life Sci. 65, 3145-3167 (2008).</li><li>Lage, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+potential+of+RNA+interference+in+drug-resistant+cancers.">Therapeutic potential of RNA interference in drug-resistant cancers.</a> Fut. Oncol. 5, 169-185 (2009).</li><li>Nguyen, T. A., Fruehauf, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transkingdom+RNA+interference+(tkRNAi):+a+novel+method+to+induce+therapeutic+gene+silencing.">Transkingdom RNA interference (tkRNAi): a novel method to induce therapeutic gene silencing.</a> Methods Mol. Biol. 514, 27-34 (2009).</li><li>Nieth, C., Priebsch, A., Stege, A., Lage, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+the+classical+multidrug+resistance+(MDR)+phenotype+by+RNA+interference+(RNAi.">Modulation of the classical multidrug resistance (MDR) phenotype by RNA interference (RNAi.</a> FEBS Lett. 545, 144-150 (2003).</li><li>Stege, A., Priebsch, A., Nieth, C., Lage, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+and+complete+overcoming+of+MDR1/P-glycoprotein-mediated+multidrug+resistance+in+human+gastric+carcinoma+cells+by+RNA+interference.">Stable and complete overcoming of MDR1/P-glycoprotein-mediated multidrug resistance in human gastric carcinoma cells by RNA interference.</a> Cancer Gene Ther. 11, 699-706 (2004).</li><li>Stein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+in+vivo+reversal+of+the+multidrug+resistance+(MDR)+phenotype+by+jet-injection+of+anti-MDR1+short+hairpin+RNA-encoding+plasmid+DNA.">Complete in vivo reversal of the multidrug resistance (MDR) phenotype by jet-injection of anti-MDR1 short hairpin RNA-encoding plasmid DNA.</a> Mol. Ther. 16, 178-186 (2008).</li><li>Xiang, S., Fruehauf, J., Li, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+hairpin+RNA-expressing+bacteria+elicit+RNA+interference+in+mammals.">Short hairpin RNA-expressing bacteria elicit RNA interference in mammals.</a> Nat. Biotechnol. 24, 697-702 (2006).</li></ol>

O número de células semeadas para a infecção e os MOI correspondentes utilizados, dependem criticamente as linhas de células sob observação e sua velocidade de crescimento. Para encontrar o número de células ideal para a semeadura, a pré-experimentos para determinar a velocidade de crescimento são fortemente recomendados. Além disso, MOIS diferentes devem ser testados, devido à limitada estender-se que as células podem suportar a invasão bacteriana sem morrer de stress. O ponto ótimo de tempo em que a re...

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Agar</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biochrom AG</td>
<td>214050</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Amphotericin B</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biochrom AG</td>
<td>A2612</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline-PBS (10 x)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen GmbH</td>
<td>14080048</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>E. coli ceq221</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cequent Pharmaceuticals Inc.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>No catalogue available, direct order</td>
</tr>
<tr>
<td>Gentamycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biochrom AG</td>
<td>A2710</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin/Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen GmbH</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Contains 5,000 units of penicillin (base) and 5,000 &mu;g of streptomycin (base)/ml utilizing penicillin G (sodium salt) and streptomycin sulfate in 0.85% saline.</td>
</tr>
<tr>
<td>Sodium chloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Merck KgaA</td>
<td>1064060500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tryptone</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco Laboratories</td>
<td>211705</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Yeast Extract</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco Laboratories</td>
<td>212750</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

bacterial delivery of rnai effectors: transkingdom rnai

Interferência de RNA (RNAi) representa um mecanismo de alto eficaz para inibição específica de expressão de mRNA. Além de seu potencial como uma ferramenta poderosa de laboratório, a via RNAi parece ser promissor para uso terapêutico. Para o desenvolvimento de interferência de RNA (RNAi) baseado em terapias, a entrega de RNAi-agentes mediadores de células-alvo é um dos grandes obstáculos. A nova estratégia para superar este obstáculo é transkingdom RNAi (tk RNAi). Esta tecnologia utiliza bactérias não-patogênicas, por exemplo, Escherichia coli, para produzir e entregar terapêutica curto hairpin RNA (shRNA) em células-alvo para induzir RNAi. A primeira geração tk RNAi-mediadora vector TRIP, contém o bacteriófago T7 promoter de regulação da expressão de um shRNA terapêutico de interesse. Além disso, TRIP tem o locus de Inv Yersinia pseudotuberculosis, que codifica invasin, que permite que as bactérias naturais não-invasivo para entrar β1 positiva de integrina células de mamíferos eo gene HlyA de Listeria monocytogenes, que produz listeriolisina O. Esta enzima permite que o shRNA terapêuticas para escapar entrada vesículas no citoplasma da célula-alvo. Constrói TRIP são introduzidos em um competente coli cepa não-patogênica coli, que codifica T7 RNA polimerase necessário para a síntese T7 promoter-driven de shRNAs. A molécula-alvo bem caracterizado de câncer associados para diferentes estratégias RNAi é ABCB1 (MDR1/P-glycoprotein, MDR1/P-gp). Esta ABC-transportador atua como uma bomba de extrusão de drogas e media o &quot;clássico&quot; resistência a múltiplas drogas ABCB1 mediada (MDR) fenótipo de células de câncer humano, que é caracterizado por um padrão específico de resistência cruzada. ABCB1 expressando diferentes células de câncer de MDR foram tratados com anti-ABCB1 expressão shRNA vector rolamento E. coli. Este procedimento resultou na ativação das vias RNAi nas células do câncer e de um regulamento considerável para baixo do mRNA codificação ABCB1, bem como a bomba de extrusão correspondente drogas. Assim, a acumulação de drogas foi reforçada no pristine células resistentes a drogas câncer eo fenótipo MDR foi revertida. Por meio deste modelo os dados fornecem a prova de conceito que tk RNAi é adequado para a modulação de câncer de fatores associados, como por exemplo ABCB1, em células de câncer humano.

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Bacterial Delivery of RNAi Effectors: Transkingdom RNAi

Para o desenvolvimento de interferência de RNA (RNAi) baseado em terapias, uma nova estratégia foi desenvolvida, transkingdom RNAi (tkRNAi). Esta tecnologia utiliza bactérias não-patogênicas de produzir e entregar terapêutica curto hairpin RNA (shRNA) em células-alvo. Aqui, tkRNAi foi aplicado com sucesso para a reversão de multirresistência clássica ABCB1 mediada (MDR) de células cancerosas.

Entrega bacteriana de RNAi Effectors: Transkingdom RNAi

RNA interference (RNAi) represents a high effective mechanism for specific inhibition of mRNA expression. Besides its potential as a powerful laboratory ...

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Identificação de fenótipos inibição do crescimento induzido pela expressão de Effectors Tipo III bacteriana em Yeast

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