Name: bacterial delivery of rnai effectors: transkingdom rnai
Uploaded: 2010-08-18T17:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bacterial Delivery of RNAi Effectors: Transkingdom RNAi at JoVE.com

El trabajo fue financiado por el subsidio no. 01GU0615 del &quot;Bundesministerium für Forschung und Technologie de Alemania (BMBF).

1) Entrega bacteriana de shRNAs <ol><li> Antes de comenzar con el cultivo bacteriano, uno tiene que preparar LB-medio y LB-agar. </li><li> Para el LB-medio pesar de extracto de levadura (0,5% w / v), Bacto triptona (1,0% w / v) y NaCl (0,6% w / v) y diluir estos componentes en agua bidestilada. Las soluciones preparadas deben ser esterilizados en autoclave y luego se vaya a utilizar. </li><li> Para las placas de agar-agar LB bacto (1,5% w / v) se debe añadir a la LB-medio anteriores a la esterilización. </li><li> Ca...

<ol>
	<li>Kr&#252;hn, A., Wang, A., Fruehauf, J. H., Lage, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+short+hairpin+RNAs+by+transkingdom+RNA+interference+modulates+the+classical+ABCB1-mediated+multidrug-resistant+phenotype+of+cancer+cells.">Delivery of short hairpin RNAs by transkingdom RNA interference modulates the classical ABCB1-mediated multidrug-resistant phenotype of cancer cells.</a> Cell Cycle. 8, 3349-3354 (2009).</li><li>Lage, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MDR1/P-glycoprotein+(ABCB1)+as+target+for+RNA+interference-mediated+reversal+of+multidrug+resistance.">MDR1/P-glycoprotein (ABCB1) as target for RNA interference-mediated reversal of multidrug resistance.</a> Curr. Drug Targets. 7, 813-821 (2006).</li><li>Lage, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+cancer+multidrug+resistance:+a+still+unsolved+problem.">An overview of cancer multidrug resistance: a still unsolved problem.</a> Cell. Mol. Life Sci. 65, 3145-3167 (2008).</li><li>Lage, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+potential+of+RNA+interference+in+drug-resistant+cancers.">Therapeutic potential of RNA interference in drug-resistant cancers.</a> Fut. Oncol. 5, 169-185 (2009).</li><li>Nguyen, T. A., Fruehauf, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transkingdom+RNA+interference+(tkRNAi):+a+novel+method+to+induce+therapeutic+gene+silencing.">Transkingdom RNA interference (tkRNAi): a novel method to induce therapeutic gene silencing.</a> Methods Mol. Biol. 514, 27-34 (2009).</li><li>Nieth, C., Priebsch, A., Stege, A., Lage, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+the+classical+multidrug+resistance+(MDR)+phenotype+by+RNA+interference+(RNAi.">Modulation of the classical multidrug resistance (MDR) phenotype by RNA interference (RNAi.</a> FEBS Lett. 545, 144-150 (2003).</li><li>Stege, A., Priebsch, A., Nieth, C., Lage, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+and+complete+overcoming+of+MDR1/P-glycoprotein-mediated+multidrug+resistance+in+human+gastric+carcinoma+cells+by+RNA+interference.">Stable and complete overcoming of MDR1/P-glycoprotein-mediated multidrug resistance in human gastric carcinoma cells by RNA interference.</a> Cancer Gene Ther. 11, 699-706 (2004).</li><li>Stein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+in+vivo+reversal+of+the+multidrug+resistance+(MDR)+phenotype+by+jet-injection+of+anti-MDR1+short+hairpin+RNA-encoding+plasmid+DNA.">Complete in vivo reversal of the multidrug resistance (MDR) phenotype by jet-injection of anti-MDR1 short hairpin RNA-encoding plasmid DNA.</a> Mol. Ther. 16, 178-186 (2008).</li><li>Xiang, S., Fruehauf, J., Li, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+hairpin+RNA-expressing+bacteria+elicit+RNA+interference+in+mammals.">Short hairpin RNA-expressing bacteria elicit RNA interference in mammals.</a> Nat. Biotechnol. 24, 697-702 (2006).</li></ol>

El número de células sembradas para la infección y se utiliza el MOI correspondientes, dependen fundamentalmente de las líneas celulares en observación y su velocidad de crecimiento. Para encontrar números de celular óptimo para la siembra, pre-experimentos para determinar la velocidad de crecimiento son muy recomendables. Además de esto, las MOI diferentes deben ser probados debido a la limitada se extiende a que las células pueden resistir la invasión bacteriana sin morir de estrés. El punto óptimo de tiem...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Agar</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biochrom AG</td>
<td>214050</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Amphotericin B</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biochrom AG</td>
<td>A2612</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline-PBS (10 x)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen GmbH</td>
<td>14080048</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>E. coli ceq221</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cequent Pharmaceuticals Inc.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>No catalogue available, direct order</td>
</tr>
<tr>
<td>Gentamycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biochrom AG</td>
<td>A2710</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin/Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen GmbH</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Contains 5,000 units of penicillin (base) and 5,000 &mu;g of streptomycin (base)/ml utilizing penicillin G (sodium salt) and streptomycin sulfate in 0.85% saline.</td>
</tr>
<tr>
<td>Sodium chloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Merck KgaA</td>
<td>1064060500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tryptone</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco Laboratories</td>
<td>211705</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Yeast Extract</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco Laboratories</td>
<td>212750</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

bacterial delivery of rnai effectors: transkingdom rnai

ARN de interferencia (ARNi) es un mecanismo altamente efectivo para la inhibición específica de la expresión del ARNm. Además de su potencial como herramienta de laboratorio poderosa, la vía de RNAi parece ser prometedora para la utilización terapéutica. Para el desarrollo de la interferencia de ARN (RNAi), las terapias basadas en la entrega de RNAi agentes mediadores de las células diana es uno de los principales obstáculos. Una nueva estrategia para superar este obstáculo es transkingdom RNAi (tk RNAi). Esta tecnología utiliza bacterias no patógenas, por ejemplo, Escherichia coli, para producir y entregar terapéutica de horquilla corta RNA (shRNA) en las células diana para inducir RNAi. Una primera generación de los conocimientos tradicionales RNAi mediar vector, viaje, contiene el promotor del bacteriófago T7 para la regulación de la expresión de un ARNhc terapéuticas de interés. Además, el lugar ha VIAJE Inv de Yersinia pseudotuberculosis que codifica invasina, lo que permite bacterias naturales no invasivas para entrar β1-integrina-positivo células de mamíferos y el gen HlyA de Listeria monocytogenes, que produce listeriolisina O. Esta enzima permite la shRNA terapéutica para escapar de la entrada de vesículas en el citoplasma de la célula diana. Construye TRIP se introducen en un tribunal competente no patógena cepa de Escherichia coli, que codifica la ARN polimerasa T7 necesarios para la T7 promotor impulsado por la síntesis de shRNAs. A bien caracterizados asociados con el cáncer molécula diana de las diferentes estrategias de RNAi es ABCB1 (MDR1/P-glycoprotein, MDR1/P-gp). Esta ABC-transportador actúa como una bomba de extrusión de drogas y media la &quot;clásica&quot; ABCB1 mediada por la resistencia a múltiples fármacos (MDR) fenotipo de las células de cáncer humano que se caracteriza por un patrón de resistencia cruzada específica. ABCB1 diferentes que expresan las células cancerosas MDR fueron tratados con anti-ABCB1 del shRNA vector de expresión E. rodamientos coli. Este procedimiento dio lugar a la activación de las vías de ARNi en las células cancerosas y una regulación considerable abajo del ARNm que codifica ABCB1, así como la bomba de extrusión de drogas correspondiente. En consecuencia, la acumulación del fármaco fue mayor en las células cancerosas resistentes a los medicamentos prístina y el fenotipo MDR fue revocada. Por medio de este modelo los datos que presente la prueba de concepto que los conocimientos tradicionales RNAi es adecuado para la modulación de los factores asociados con el cáncer, por ejemplo, ABCB1, en ​​células de cáncer humano.

Watch this Scientific Journal Video about Bacterial Delivery of RNAi Effectors: Transkingdom RNAi at JoVE.com

Bacterial Delivery of RNAi Effectors: Transkingdom RNAi

Para el desarrollo de la interferencia de ARN (RNAi), las terapias basadas en una nueva estrategia se ha desarrollado, transkingdom RNAi (tkRNAi). Esta tecnología utiliza bacterias no patógenas para producir y entregar terapéutica de horquilla corta RNA (shRNA) en las células diana. Aquí, tkRNAi se aplicó con éxito para la reversión de la resistencia a múltiples fármacos clásicos ABCB1 mediada (MDR) de las células cancerosas.

Entrega bacteriana de RNAi efectores: Transkingdom RNAi

RNA interference (RNAi) represents a high effective mechanism for specific inhibition of mRNA expression. Besides its potential as a powerful laboratory ...

Research

JoVE Journal

Biology

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A. gambiae)

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes A. gambiae

Protocolo para ensayos de RNAi en mosquitos adultos (A. gambiae)

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video ...

Investigación

Biología

Localized RNAi and Ectopic Gene Expression in the Medicinal Leech

Localizada RNAi y la expresión génica ectópico en la sanguijuela medicinal

In this video, we show the use of a pneumatic capillary gun for the accurate biolistic delivery of reagents into live tissue. We use the procedure to ...

Identification of Growth Inhibition Phenotypes Induced by Expression of Bacterial Type III Effectors in Yeast

Identificación de los fenotipos de inhibición del crecimiento inducida por la expresión de tipo bacteriana efectores III en la levadura

Many Gram-negative pathogenic bacteria use a type III secretion system to translocate a suite of effector proteins into the cytosol of host cells. Within ...

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

MISIÓN esiRNA sobre el cribado del ARNi en células de mamífero

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

RNAi interferencia por inyección de dsRNA en Drosophila Los embriones

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements ...

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

RNAi mediada por derribo de genes y transgénesis por microinyección en el nematodo Necromenic Pristionchus pacificus</em

Although it is increasingly affordable for emerging model organisms to obtain completely sequenced genomes, further in-depth gene function and expression ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi de detección para identificar fenotipos postembrionarios en C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

Cuantitativos y automatizada de alto rendimiento del genoma completo de RNAi pantallas en C. elegans</em

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. ...

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

RNAi mediada por Gene y Derribo<em&gt; En Vivo</em&gt; Ensayo de diuresis en Mujeres Adultas<em&gt; Aedes aegypti</em&gt; Los mosquitos

This video protocol demonstrates an effective technique to knockdown a particular gene in an insect and conduct a novel bioassay to measure excretion ...

Phosphopeptide Analysis of Rodent Epididymal Spermatozoa

Análisis Phosphopeptide de roedores epidídimo Espermatozoides

Spermatozoa are quite unique amongst cell types. Although produced in the testis, both nuclear gene transcription and translation are switched off once ...