Name: bacterial delivery of rnai effectors: transkingdom rnai
Uploaded: 2010-08-18T17:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bacterial Delivery of RNAi Effectors: Transkingdom RNAi at JoVE.com

Arbetet stöddes av bidrag nr. 01GU0615 av &quot;Bundesministerium für Forschung und Technologie (BMBF).

1) Bakteriell Leverans av shRNAs <ol><li> Innan du börjar med bakteriekultur, måste man förbereda LB-medium och LB-agar. </li><li> För LB-medium väga jästextrakt (0,5% w / v), Bacto trypton (1,0% w / v) och NaCl (0,6% w / v) och späd dessa komponenter i aqua bidest. Det färdiga lösningar måste steriliseras i en autoklav och är sedan redo att användas. </li><li> För LB-agarplattor Bacto agar (1,5% w / v) måste läggas till LB-mediet tidigare sterilisering. </li><li> Hetta upp LB-agar i mikrovågsugnen til...

<ol>
	<li>Kr&#252;hn, A., Wang, A., Fruehauf, J. H., Lage, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+short+hairpin+RNAs+by+transkingdom+RNA+interference+modulates+the+classical+ABCB1-mediated+multidrug-resistant+phenotype+of+cancer+cells.">Delivery of short hairpin RNAs by transkingdom RNA interference modulates the classical ABCB1-mediated multidrug-resistant phenotype of cancer cells.</a> Cell Cycle. 8, 3349-3354 (2009).</li><li>Lage, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MDR1/P-glycoprotein+(ABCB1)+as+target+for+RNA+interference-mediated+reversal+of+multidrug+resistance.">MDR1/P-glycoprotein (ABCB1) as target for RNA interference-mediated reversal of multidrug resistance.</a> Curr. Drug Targets. 7, 813-821 (2006).</li><li>Lage, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+cancer+multidrug+resistance:+a+still+unsolved+problem.">An overview of cancer multidrug resistance: a still unsolved problem.</a> Cell. Mol. Life Sci. 65, 3145-3167 (2008).</li><li>Lage, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+potential+of+RNA+interference+in+drug-resistant+cancers.">Therapeutic potential of RNA interference in drug-resistant cancers.</a> Fut. Oncol. 5, 169-185 (2009).</li><li>Nguyen, T. A., Fruehauf, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transkingdom+RNA+interference+(tkRNAi):+a+novel+method+to+induce+therapeutic+gene+silencing.">Transkingdom RNA interference (tkRNAi): a novel method to induce therapeutic gene silencing.</a> Methods Mol. Biol. 514, 27-34 (2009).</li><li>Nieth, C., Priebsch, A., Stege, A., Lage, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+the+classical+multidrug+resistance+(MDR)+phenotype+by+RNA+interference+(RNAi.">Modulation of the classical multidrug resistance (MDR) phenotype by RNA interference (RNAi.</a> FEBS Lett. 545, 144-150 (2003).</li><li>Stege, A., Priebsch, A., Nieth, C., Lage, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+and+complete+overcoming+of+MDR1/P-glycoprotein-mediated+multidrug+resistance+in+human+gastric+carcinoma+cells+by+RNA+interference.">Stable and complete overcoming of MDR1/P-glycoprotein-mediated multidrug resistance in human gastric carcinoma cells by RNA interference.</a> Cancer Gene Ther. 11, 699-706 (2004).</li><li>Stein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+in+vivo+reversal+of+the+multidrug+resistance+(MDR)+phenotype+by+jet-injection+of+anti-MDR1+short+hairpin+RNA-encoding+plasmid+DNA.">Complete in vivo reversal of the multidrug resistance (MDR) phenotype by jet-injection of anti-MDR1 short hairpin RNA-encoding plasmid DNA.</a> Mol. Ther. 16, 178-186 (2008).</li><li>Xiang, S., Fruehauf, J., Li, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+hairpin+RNA-expressing+bacteria+elicit+RNA+interference+in+mammals.">Short hairpin RNA-expressing bacteria elicit RNA interference in mammals.</a> Nat. Biotechnol. 24, 697-702 (2006).</li></ol>

Cellen Antalet seedade för infektion och motsvarande MOI använts, kritiskt beroende av cellinjer under observation och deras hastighet av tillväxt. Att hitta optimala cell nummer för sådd, är pre-experiment för att bestämma hastigheten på tillväxt rekommenderas starkt. Utöver detta bör olika MOIS testas på grund av begränsad omfattning som cellerna tål bakteriell invasion utan att dö av stress. Den optimala tidpunkt då ner regleringen av gener under uppsikt kan variera. Det rekommenderas att utföra exp...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Agar</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biochrom AG</td>
<td>214050</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Amphotericin B</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biochrom AG</td>
<td>A2612</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline-PBS (10 x)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen GmbH</td>
<td>14080048</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>E. coli ceq221</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cequent Pharmaceuticals Inc.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>No catalogue available, direct order</td>
</tr>
<tr>
<td>Gentamycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biochrom AG</td>
<td>A2710</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin/Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen GmbH</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Contains 5,000 units of penicillin (base) and 5,000 &mu;g of streptomycin (base)/ml utilizing penicillin G (sodium salt) and streptomycin sulfate in 0.85% saline.</td>
</tr>
<tr>
<td>Sodium chloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Merck KgaA</td>
<td>1064060500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tryptone</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco Laboratories</td>
<td>211705</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Yeast Extract</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco Laboratories</td>
<td>212750</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

bacterial delivery of rnai effectors: transkingdom rnai

RNA-interferens (RNAi) är en hög effektiv mekanism för specifika hämning av mRNA uttryck. Förutom dess potential som ett kraftfullt laboratorium verktyg verkar RNAi väg att lovande för terapeutisk användning. För utveckling av RNA-interferens (RNAi)-baserade terapier, leverans av RNAi-förmedlande agenter till målceller är en av de största hindren. En roman strategi för att övervinna detta hinder är transkingdom RNAi (TK RNAi). Denna teknik använder icke-patogena bakterier, t.ex. Escherichia coli, att producera och leverera terapeutiska korta hårnål RNA (shRNA) i målceller att inducera RNAi. En första generationens tk RNAi-medla vektor, TRIP, innehåller bakteriofag T7 promotor för uttryck reglering av ett terapeutiskt shRNA av intresse. Dessutom har resan Inv locus från Yersinia pseudotuberculosis som kodar invasin, som tillåter naturlig icke-invasiv bakterier att komma in β1-integrin-positiv däggdjursceller och HlyA genen från Listeria monocytogenes, som producerar listeriolysin O. Detta enzym kan den terapeutiska shRNA att fly från inträde blåsor i cytoplasman i målcellen. TRIP konstruktioner införs till en kompetent icke-patogena Escherichia coli stam som kodar T7 RNA-polymeras är nödvändiga för T7 promotorn driven syntes av shRNAs. En väldefinierad cancer-associerade målmolekyl för olika RNAi strategier ABCB1 (MDR1/P-glycoprotein, MDR1/P-gp). Denna ABC-transportör fungerar som en drog extrudering pump och förmedlar den &quot;klassiska&quot; ABCB1-medierad multidrogresistensgenen (MDR) fenotyp av mänskliga cancerceller som kännetecknas av en viss korsresistens mönster. Olika ABCB1-uttryckande MDR cancerceller behandlades med anti-ABCB1 shRNA uttryck vektor med E. coli. Detta förfarande resulterade i aktivering av RNAi banorna inom cancerceller och en betydande ner reglering av ABCB1 kodning mRNA samt motsvarande drogen extrudering pump. Följaktligen var ackumulering av läkemedlet förbättras i den orörda resistenta cancerceller och MDR fenotypen den omvända. Med hjälp av denna modell uppgifterna ger proof-of-concept som tk RNAi är lämplig för modulering av cancer-associerade faktorer, t.ex. ABCB1, i humana cancerceller.

Watch this Scientific Journal Video about Bacterial Delivery of RNAi Effectors: Transkingdom RNAi at JoVE.com

Bacterial Delivery of RNAi Effectors: Transkingdom RNAi

För utveckling av RNA-interferens (RNAi)-baserade terapier, var en roman strategi utvecklats, transkingdom RNAi (tkRNAi). Denna teknik använder icke-patogena bakterier att producera och leverera terapeutiska korta hårnål RNA (shRNA) i målceller. Här var tkRNAi framgång använts för återföring av klassisk ABCB1-medierad multidrogresistensgenen (MDR) av cancerceller.

Bakteriell Leverans av RNAi Effektenheter: Transkingdom RNAi

RNA interference (RNAi) represents a high effective mechanism for specific inhibition of mRNA expression. Besides its potential as a powerful laboratory ...

Research

JoVE Journal

Biology

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A. gambiae)

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes A. gambiae

Protokoll för RNAi-tester på vuxna myggor (A. gambiae)

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video ...

Localized RNAi and Ectopic Gene Expression in the Medicinal Leech

Lokaliserad RNAi och ektopisk Gene Expression i läkemedlet Leech

In this video, we show the use of a pneumatic capillary gun for the accurate biolistic delivery of reagents into live tissue. We use the procedure to ...

Identification of Growth Inhibition Phenotypes Induced by Expression of Bacterial Type III Effectors in Yeast

Identifiering av fenotyper tillväxthämning orsakad av Redovisning av Bakterie Typ III Effektenheter i jäst

Many Gram-negative pathogenic bacteria use a type III secretion system to translocate a suite of effector proteins into the cytosol of host cells. Within ...

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

UPPDRAG esiRNA för RNAi screening i däggdjursceller

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

RNAi Störningar av dsRNA Injektion i Drosophila Embryon

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements ...

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

RNAi Medierad Gene Knockdown och genmodifiering genom mikroinjektion i Necromenic Nematode Pristionchus pacificus</em

Although it is increasingly affordable for emerging model organisms to obtain completely sequenced genomes, further in-depth gene function and expression ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi screening identifiera Postembryonic fenotyper i C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

Kvantitativa och automatisk hög genomströmning Genomvid RNAi skärmar i C. elegans</em

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. ...

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

RNAi-mediated gene Knockdown och<em&gt; In Vivo</em&gt; Diures Analys hos vuxna kvinnliga<em&gt; Aedes aegypti</em&gt; Myggor

This video protocol demonstrates an effective technique to knockdown a particular gene in an insect and conduct a novel bioassay to measure excretion ...

Phosphopeptide Analysis of Rodent Epididymal Spermatozoa

Fosfopeptiden Analys av gnagare Epididymal Spermier

Spermatozoa are quite unique amongst cell types. Although produced in the testis, both nuclear gene transcription and translation are switched off once ...