Name: immunofluorescent detection of two thymidine analogues (cldu and idu) in primary tissue
Uploaded: 2010-12-07T16:35:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues CldU and IdU in Primary Tissue at JoVE.com

Stöds av JDRF, NIH (R01-DK081469), Commonwealth of Pennsylvania (Center for Excellence inom regenerativ medicin bevilja 4100043362), den March of Dimes (Basil O&#39;Connor Startat Scholar Research Award) och ett University of Pennsylvania DERC pilotprojekt och genomförbarhet bidrag (DK19525).

1. Märkning Vävnader med CldU och IDU <ol><li> Lös tymidinanaloger (CldU eller IDU) i vatten. Väg 1 mg / ml i varje kemiska och lägga till separata glas flaskor med destillerat vatten. Vi förbereder typiskt 1 liter av varje åt gången. </li><li> Lös upp kemikalier på ett rör tallrik eller annan form av omrörare. CldU löses upp i 10 min. av agitation i rumstemperatur. IDU kräver mer än en timme på agitation vid 37 ° C i en shaker. Vattentäkter kan påverka IDU löslighet. Om IDU kvar stängas av efter en natt skakningar, prova en renare källa av vatten. Lösningarna lagras vid 4 ° C i mörker. </li><li> Administrera den första tymidinfosforylas innehåller lösning (antingen CldU eller IDU) till möss i önskad märkning period. Låt inte möss ha tillgång till utan etikett vatten under etiketten. När den angivna märkningen perioden är klar, börjar en wash-out med omärkta vatten i minst 24 timmar (tymidin innehåller analoger har serum halveringstid på flera timmar). Administrera den andra tymidinfosforylas innehåller lösning (antingen CldU eller IDU) till möss i önskad märkning period. Fyll vattenflaskor regelbundet för att förhindra uttorkning! </li><li> Alternativt kan mössen märkas med sekventiell intraperitoneal injektion av CdlU och sedan IDU. Förbered CldU eller IDU på 10 mg / ml koncentration. IDU kan kräva droppvis tillsättning av koncentrerad natriumhydroxidlösning följt av kraftig omskakning att gå i suspension. Tillsätt inte överskott av natriumhydroxid. Lägg en droppe natriumhydroxid till en 10 ml lösning av injektionsmissbrukare följt av en timmes omrörning vid 37 ° C i en shaker. Om inte i lösning, upprepa tillsats av natriumhydroxid. Injicera 100mcg per g kroppsvikt i intraperitoneal rymden. </li><li> Kontrollglas är viktiga för detta protokoll. Som ett resultat rekommenderar vi utredare genomföra flera varianter av tymidinanalog märkning för att säkerställa sensitivitet och specificitet. Dessa bör omfatta 1. Möss som bara var märkta med CldU, 2. Möss som bara var märkta med IDU, 3. Möss som sekventiellt var märkta med CldU och sedan IDU, 4. Möss som sekventiellt var märkta i omvänd ordning, först med IDU och sedan CldU, 5 Möss som hånar märkta med bara vatten. När lära sig etikett med CldU och IDU bör utredare utför alltid ut hela protokollet med alla 5 ovan uppsättningar av kontroll bilderna från vävnaden av intresse. </li></ol> 2. Tissue Harvest, fixering, och preparatet <ol><li> Med hjälp av lämpliga bedövning, utföra dödliga överdoser och sedan offra mus via exsanguination. Ta bort friska vävnader och fäst med 4% paraformalehyde vid 4 ° C i 24 timmar. Överföring vävnad till 01:04 formalin buffert och förvara vid 4 ° C för inbäddning. </li><li> Alternativt, utföra dödliga överdoser och sedan BEGJUTA musen via hjärtats vänstra kammare med koksaltlösning tills blodet utsöndras från kroppen, sedan omedelbart BEGJUTA med 30-50 cc 4% paraformaldehyd. Ta bort vävnader av intresse och butik i 01:04 Formalin buffert vid 4 ° C för inbäddning. </li><li> Efter vävnad dehydrering och paraffininbäddning, skär 5-micron vävnadssnitt och placera på laddade bilder. Grädda bilderna vid 65 ° C i 16 timmar för att säkerställa vidhäftning av vävnad att glida (viktigt med steg antigenåtervinning nedan). </li></ol> 3. Uttorkning, Permeabilization och antigenåtervinning <ol><li> Ta bort överflödig paraffin genom att sänka ned objektglasen i två xylen bad för 5 min. vardera. </li><li> Rehydrera vävnaden genom att sänka ned objektglasen i etanol utspätt med vatten: 100, 95, 90, 80 70 och 50%. Blötlägg objektglasen i 3 min. vid varje koncentration som börjar med 100% och går mot 50% för den slutliga nedsänkning. </li><li> Tvätta diabilder i 5 min. i 1x PBS. </li><li> Permeabilize celler genom att sänka ner bilder i 0,2% Triton-X lösning för 5 min (gjorde färsk varje gång). </li><li> Förbered diabilder för mikrovågsugn vävnad antigenåtervinning. Placera objektglasen i ett glas bägare med en tillräcklig volym 0.01M pH 6,0 natriumcitrat buffert, så att lösningen täcker 5 cm ovanför toppen av diabilder till svars för avdunstning. </li><li> Microwave diabilder tills lösningen är kokande (3-10 min. Med full effekt). Minska makten tills lösningen är långsamt kokande (10-80%) och fortsätter i ytterligare 20 min. Kontrollera mikrovågsugn regelbundet för att säkerställa att lösningen ligger kvar på en långsam koka. </li><li> Placera bägaren som innehåller bilder på en bänkbaserade och låt försiktigt svalna till rumstemperatur (ca 2 timmar). </li><li> Kontrollera att bilderna är rumstempererade med en termometer. </li><li> Doppa objektglasen i 1.5N HCL för 40 min. vid rumstemperatur. </li><li> Tvätta diabilder två gånger i 1X PBS, 5 min. per tvätt. </li></ol> 4. Primära och sekundära antikroppar <ol><li> Det är viktigt att bilderna är fortfarande mycket fuktigt genom hela protokollet. Torra vävnad kommer att ha mycket mer auto-Fluorescens, vilket gör den resulterande bilderna oanvändbara. För att förhindra att dö, bearbeta en bild i taget. </li><li> Circle varje avsnitt på bilderna med en vätska blockering (dvs, vax) penna. Placera glider tillbaka in i behållaren för 1x PBS. </li><li> Gör en fuktig inkubation kammare genom att lägga våta pappershanddukar som läggs direkt på botten av en lufttät plastbehållare. </li><li> Make up blockerande lösningen av 10% åsna serum utspätt i 1x PBS. Det är viktigt att helt täcka varje avsnitt med lösningen. För vävnadssnitt som är 1 x 1,5 centimeter, är en volym av 50 mikro-liter lösning per avsnitt räcker. </li><li> Tillsätt den blockerande lösningen på bilderna. Ta bort bilden från 1x PBS och eliminera överflödig vätska genom att försiktigt knacka bilden kanten på en hög med torrt hushållspapper. Placera bilden i inkubation kammare och lägga till 50 mikro-liter 10% blockera lösning till varje avsnitt. När alla bilder är klara stäng behållaren och inkubera vid rumstemperatur i 1 timme. </li><li> Förbered primära antikroppen utspädning för att upptäcka IDU. Späd mus-anti-BrdU på en 1:250 koncentration i 5% åsna serum görs i 1x PBS. Kranen blockera lösning från bilden och placera tillbaka in i inkubation kammaren. Lägg till ovanstående primära antikroppen till varje avsnitt och inkubera över natten vid 4 ° C. </li><li> Förbered hög stringens tvätt (vilket minimerar bindande genom mus-anti-BrdU immunsera till CldU). Fyll färsk låg buffert salt TBST (36mm Tris, 50mm NaCl, 0,5% Tween-20, pH 8,0). Du behöver 40 ml buffert per par av bilder. Tillsätt 40 ml buffert i varje 50 ml koniska rör. Innan du lägger bilderna, förvärma lösningen till 37 ° C. </li><li> Två i taget, ta bort bilder från inkubation avdelningen, placera dem back-to-back (så att vävnadsprover ansiktet bort från varandra) och knacka bort överflödigt primära antikroppen. Placera objektglasen i rören fylls med låg salthalt TBST och täcka. Skaka rören i 20 minuter. i en skakande bakteriekultur inkubator med temperatur på 37 ° C, och hastigheten satt till 225 rpm. </li><li> Tvätta bilderna två gånger i färskt 1X PBS. 5 min. per tvätt. </li><li> Förbereda nästa primära antikroppen lösning för detektion av CldU och vävnad antigen, om så önskas. Späd råtta anti-BrdU på en 1:250 koncentration i 5% åsna serum görs i 1x PBS. Späd primärt antiserum mot vävnaden antigen på att arbeta koncentration i den primära antikroppen lösningen. </li><li> Tryck överskott 1x PBS bort av bilder och placera dem i inkubation kammaren. Lägg primära antikroppen till varje avsnitt och inkubera över natten vid 4 ° C. </li><li> Tvätta bilderna två gånger i färskt 1X PBS. 5 min. per tvätt. </li><li> Förbered sekundär antikropp lösningen. Späd Cy2 åsna anti-råtta till 1:250 och Cy5 åsna anti-mus till 1:500 i en 1X PBS lösning som innehåller 5% åsna serum. Lägg Cy3 sekundärt att upptäcka primära arter av vävnad antigen antiserum. Dessutom, späd en 0,4 mg / ml stamlösning av DAPI till 1:150 i sekundär antikropp lösning. </li><li> Tryck överskott 1X PBS bort diabilder och plats i inkubation kammaren. Lägg sekundär antikropp lösning till varje avsnitt och inkubera i 1 timme i rumstemperatur. </li><li> Tvätta bilderna två gånger i färskt 1X PBS. 5 min. per tvätt. </li><li> Tryck överskott 1X PBS bort av diabilder och följa skyddsglas med Förläng Guld anti-fade montering media (Använd INTE Vectashield med dyanine färgämnen!). Tryck på täckglas för att eliminera luftbubblor. Förvaras vid 4 ° C. </li></ol> 5. Avbildning och analys <ol><li> Bild vävnaden av intresse med en fluorescerande mikroskop utrustat med en hög energi ljuskälla, Plan-apokromatiska mål och en hög effektivitet mikroskopkamera (t.ex. Hamamatsu Orca ER). Ta bilder i AMCA (DAPI), Cy2 (CldU), Cy3 (Tissue antigen) och Cy5 (IDU) kanaler. Sammanfoga bilder för att skapa en enda flera lager bildfil. </li><li> Om det utförs korrekt kommer DAPI färgade kärnor vara homogent ljus. Tissue antigen (t.ex. insulin) bör avslöja celler av intresse. Om färgning med DAPI eller vävnad-antigen är svag eller inkonsekvent, fördjupa bilden i 1X PBS över natten för att ta bort täckglas och upprepad tillämpning av sekundära antiserum. </li><li> Fokus på vävnad antigen i Cy3. Kolla CldU och IDU färgning i Cy2 och Cy5 kanaler, växla mellan kanalerna. Leta efter potentiella korsreaktivitet mellan markörer, vilket framgår av överdriven IDU och CldU co-positivitet. Leta efter vävnader som endast innehåller CldU eller IDU. Brist på CldU eller injektionsmissbrukare positiva kärnor kan tyda på ett tekniskt problem med märkning eller färgning. I det här fallet, leta efter en mycket replikationsförmåga vävnad (t.ex. lymfkörtel). </li><li> Analysera bilder. Visa skikt innehåller DAPI och vävnad antigen. Med hjälp av en whiteboard markör i den dominerande handen och en celltalsräknare i den icke-dominanta handen, märka varje kärna med en kontrasterande märke med en torr radera markör (aka whiteboard markör). Räkna DAPI positiva celler inom mjukpapper av intresse. Spela in totalt cellantal. Använd en torr suddgummi för att ta bort märken. Visa lagrets som innehåller DAPI, vävnad antigen, och CldU. Räkna CldU positiva celler inom mjukpapper av intresse. Spela CldU celltal men inte radera märken. Ändra display för att visualisera skikt innehållande väv antigen CldU och IDU. Räkna CldU IDU dubbla positiva celler. Spela värde, radera alla märken, och visa lager som innehåller DAPI, vävnad antigen, och IDU. Räkna det totala antalet injektionsmissbrukare positiva celler i vävnaden av intresse. Spela IDU celltal. </li></ol> 6. Representativa resultat Vi märkta sekventiellt 6 veckor gamla honmöss med CldU i en vecka och sedan injektionsmissbrukare i två veckor, följt av omedelbar offer. Pancreata färgades att upptäcka CldU, IDU, och insulin (ett vävnadsprov antigen), samt DAPI. Holmar var enhetligt färgade med insulin. CldU färgade kärnor var skild från IDU färgade kärnor (Figur 2). Många kärnor utanför den lilla ön var CldU injektionsmissbrukare co-positiv (figur 2, längst ner till höger, vita pilar). En enda insulin positiv cell hade nukleär färgning för både CldU och IDU (figur 2, längst ner till höger, magenta pil). Möss. Alla experiment med möss utfördes enligt riktlinjerna i IACUC kommittén för barnsjukhuset i Philadelphia. Kvinna B6.129 F1 vildtyp möss köptes från Taconic (Germantown New York), som ligger på försöksdjur anläggning vid barnsjukhuset i Philadelphia, och matas Mus Diet 5015 från PMI Nutrition International (Richmond. Indiana). Märkning strategi. Genom att märka den första händelsen celldelning med CldU (markerade grönt i detta system) och den andra celldelning med IDU (markerat rött i detta system), sekventiell celldelning resulterar i samarbete märkta celler med både CldU och IDU (grön / röd) . Representativa resultat av tymidin märkning av bukspottkörtelns celler omsättning inom möss. Immunofluorescens bild av en mus bukspottkörteln med holme Langerhanska i centrum. Musen var infunderas med CldU under 1 vecka och sedan injektionsmissbrukare i 2 veckor i dricksvattnet före omedelbara offer. Bukspottkörteln prov behandlades enligt protokollet. 40x objektiv bilder, med distinkta lager visas som lämpar sig för att räkna. Sammanslagna bilder innehåller DAPI (vit) CldU (grön), IDU (röd), insulin (gul). (Övre vänstra) DAPI och insulin. (Övre högra) CldU och insulin. (Nedre, vänster) IDU och insulin. (Nedre högra) CldU, IDU, och insulin. Skala bar: 100μm. <img src="/files/ftp_upload/2166/2166fig1.jpg" alt="Figur 1" /> Figur 1. Labeling strategi. Genom att märka den första händelsen celldelning med CldU (markerade grönt i detta system) och den andra celldelning med IDU (markerat rött i detta system), sekventiell celldelning resulterar i samarbete märkta celler med både CldU och IDU (grön / röd) . <img src="/files/ftp_upload/2166/2166fig2.jpg" alt="Figur 2" /> Figur 2. Representativa resultat av tymidin märkning av bukspottkörtelns celler omsättning inom möss. Immunofluorescens bild av en mus bukspottkörteln med holme Langerhanska i centrum. Musen var infunderas med CldU under 1 vecka och sedan injektionsmissbrukare i 2 veckor i dricksvattnet före omedelbara offer. Bukspottkörteln prov behandlades enligt protokollet. 40x objektiv bilder, med distinkta lager visas som lämpar sig för att räkna. Sammanslagna bilder innehåller DAPI (vit) CldU (grön), IDU (röd), insulin (gul). (Övre vänstra) DAPI och insulin. (Övre högra) CldU och insulin. (Nedre, vänster) IDU och insulin. (Nedre högra) CldU, IDU, och insulin. Skala bar: 100μm.

<ol>
	<li>Teta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+regeneration+of+adult+Beta+cells+does+not+involve+specialized+progenitors.">Growth and regeneration of adult Beta cells does not involve specialized progenitors.</a> Dev Cell. 12 (5), 817-817 (2007).</li><li>Kiel, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haematopoietic+stem+cells+do+not+asymmetrically+segregate+chromosomes+or+retain+BrdU.">Haematopoietic stem cells do not asymmetrically segregate chromosomes or retain BrdU.</a> Nature. 449 (7159), 238-238 (2007).</li><li>Bersell, K., Arab, S., Haring, B., Kuhn, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuregulin1/ErbB4+signaling+induces+cardiomyocyte+proliferation+and+repair+of+heart+injury.">Neuregulin1/ErbB4 signaling induces cardiomyocyte proliferation and repair of heart injury.</a> Cell. 138, 257-257 (2009).</li><li>Rankin, M. M., Kushner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+Beta+Cell+Proliferation+Is+Severely+Restricted+with+Advanced+Age.">Adaptive Beta Cell Proliferation Is Severely Restricted with Advanced Age.</a> Diabetes. , (2009).</li><li>He, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclin+D2+Protein+Stability+Is+Regulated+in+Pancreatic+Beta+Cells.">Cyclin D2 Protein Stability Is Regulated in Pancreatic Beta Cells.</a> Mol Endocrinol. , (2009).</li><li>Kushner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-cell+growth:+an+unusual+paradigm+of+organogenesis+that+is+cyclin+D2/Cdk4+dependent.">Beta-cell growth: an unusual paradigm of organogenesis that is cyclin D2/Cdk4 dependent.</a> Cell Cycle. 5 (3), 234-234 (2006).</li><li>Teta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Very+slow+turnover+of+beta-cells+in+aged+adult+mice.">Very slow turnover of beta-cells in aged adult mice.</a> Diabetes. 54 (9), 2557-2557 (2005).</li><li>Wilson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+reversibly+switch+from+dormancy+to+self-renewal+during+homeostasis+and+repair.">Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair.</a> Cell. 135 (6), 1118-1118 (2008).</li><li>Van Nest, G., Raman, R. K., Rutter, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+dexamethasone+and+5-bromodeoxyuridine+on+protein+synthesis+and+secretion+during+in+vitro+pancreatic+development.">Effects of dexamethasone and 5-bromodeoxyuridine on protein synthesis and secretion during in vitro pancreatic development.</a> Dev Biol. 98 (2), 295-295 (1983).</li><li>Githens, S., Pictet, R., Phelps, P., Rutter, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-bromodeoxyuridine+may+alter+the+differentiative+program+of+the+embryonic+pancreas.">5-bromodeoxyuridine may alter the differentiative program of the embryonic pancreas.</a> J Cell Biol. 71 (2), 341-341 (1976).</li><li>Walther, B. T., Pictet, R. L., David, J. D., Rutter, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+mechanism+of+5-bromodeoxyuridine+inhibition+of+exocrine+pancreas+differentiation.">On the mechanism of 5-bromodeoxyuridine inhibition of exocrine pancreas differentiation.</a> J Cell Biol. 249 (6), 1953-1953 (1974).</li><li>Chen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+pancreatic+islet+cell+proliferation+by+heavy+water+labeling.">Measurement of pancreatic islet cell proliferation by heavy water labeling.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 293 (5), E1459-E1459 (2007).</li><li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo.">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (7), 2415-2415 (2008).</li><li>Best, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click+chemistry+and+bioorthogonal+reactions:+unprecedented+selectivity+in+the+labeling+of+biological+molecules.">Click chemistry and bioorthogonal reactions: unprecedented selectivity in the labeling of biological molecules.</a> Biochemistry. 48 (28), 6571-6571 (2009).</li><li>Buck, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+S-phase+cell+cycle+progression+using+5-ethynyl-2'-deoxyuridine+incorporation+with+click+chemistry,+an+alternative+to+using+5-bromo-2'-deoxyuridine+antibodies.">Detection of S-phase cell cycle progression using 5-ethynyl-2'-deoxyuridine incorporation with click chemistry, an alternative to using 5-bromo-2'-deoxyuridine antibodies.</a> Biotechniques. 44 (7), 927-927 (2008).</li><li>Huising, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRFR1+is+expressed+on+pancreatic+beta+cells,+promotes+beta+cell+proliferation,+and+potentiates+insulin+secretion+in+a+glucose-dependent+manner.">CRFR1 is expressed on pancreatic beta cells, promotes beta cell proliferation, and potentiates insulin secretion in a glucose-dependent manner.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (2), 912-912 (2008).</li><li>Reimann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+sensing+in+L+cells:+a+primary+cell+study.">Glucose sensing in L cells: a primary cell study.</a> Cell Metab. 8 (6), 532-532 (2008).</li><li>Doupe, D. P., Klein, A. M., Simons, B. D., Jones, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ordered+architecture+of+murine+ear+epidermis+is+maintained+by+progenitor+cells+with+random+fate.">The ordered architecture of murine ear epidermis is maintained by progenitor cells with random fate.</a> Dev Cell. 18 (2), 317-317 (2010).</li></ol>

Alla experiment med möss har utförts på djuret anläggningen vid barnsjukhuset i Philadelphia i enlighet med riktlinjerna för institutionella Animal skötsel och användning kommittén (IACUC).

Vårt förhållningssätt till tymidin metod för märkning av celler omsättningen har många potentiella tillämpningar inom biomedicinsk forskning. Hittills har vi koncentrerat oss på bukspottkörteln, men vi har också tillämpat denna strategi för att undersöka cell omsättning i hud, tarm, lever, binjure, njurar, testiklar, äggstockar, sköldkörtel, lymfknutor, blodbildningen, och hjärnan 1. Eftersom cell omsättning varierar från vävnad till vävnad, bör märkning strategier anpassas för att få de mest övertygande information från orgeln av intresse. Morrison och kollegor använde CldU och IDU för 1 dag varje att märka blodbildningen 2. Kuhn och kollegor använder CldU och IDU för 4 dagar vardera för att upptäcka celldelning i regenererande myokardiet 3. Däremot har vi använt CldU och IDU upp till 9 månader totalt att märka basalcellscancer omsättning inom pankreasöarna, en vävnad med minimal cell omsättning djuret åldrarna 1,4-6. Den mest uppenbara potentiella tillämpningen av vår märkning strategi för studier för att definiera cell omsättning inom mjukpapper homeostas. Men vår teknik har flera andra potentiella tillämpningar. Till exempel har vi nyligen också tillämpat denna teknik för att identifiera onkogena omvandling i vävnader, där fokusområdena av ökad replikering kan lätt identifieras genom ökad integrering av CldU eller IDU 5. Morrison och kollegor använde CldU och IDU för 1 dag varje för att testa för etikett behålla beteendet hos hematopoetiska stamceller 2. Vi har också ansökt sekventiell märkning tymidinanalog att avgöra om transit-förstärkning celler bidrar till tillväxt och förnyelse av vävnader 1. I denna ansökan sekventiell tillförsel av tymidinanaloger representerar en ny metod för att studera uppkomst och överlevnad av celler som deltar i vävnaden homeostas. Tymidinanaloger bör inte användas utan försiktighet. Syntetiska tymidinanaloger har potential toxicitet på delande celler, och deras användning kan teoretiskt påverka cellens omsättning på växande djur. Tymidinanaloger har använts som radiosensitizing agenter för cancerpatienter och kan bromsa cellens omsättning. Således uppmanar vi utredarna att försiktigt undersöka potentiella toxicitet i deras vävnad av intresse. Till exempel Trumpp och kollegor tycker att systemisk BrdU kan tvinga hematopoetiska stamceller in cellcykeln 7. Till exempel observerade Rutter och kollegor att hög dos tymidinanaloger är giftiga att utveckla bukspottkörteln 8. På senare tid Hellerstein och kollegor vid KineMed fann Inc att BrdU administrationen bromsar inom holmen spridning med 16-25% hjälp av en egenutvecklad tungt teknik vatten märkning 9. Hela holmen preparat som används av Hellerstein och kollegor innehöll många andra endokrina och icke-endokrina celltyper, som kan omfatta så mycket som 50% av det totala holme preparat. Däremot finner vi att långvarig infusion av BrdU inte påverkar beta-cellproliferation hos unga vuxna möss, mätt som Ki67 uttryck 4. Likaså verkar långsiktig förvaltning av CldU och injektionsmissbrukare inte försämra beta-expansionen cellmassan 1. Dessutom beta cellproliferation priser är likvärdiga mellan möss märkt med BrdU under lång tid och möss som endast är märkta för ett par timmar (priser är normaliserat till motsvarande tidsperioder). Tillsammans utgör dessa resultat tyder på att möss säkert tål långsiktigt låg dosering av tymidinanaloger. Ändå kan vi inte utesluta potentiella toxiciteten av tymidinanaloger i bukspottkörteln celltillväxt. Som ett resultat, fortsätter vi att utföra kontroller vid märkning möss med tymidinanaloger, och uppmana andra forskare att göra det också. Vår teknik för sekventiell tymidinanalog märkning är inte utan fallgropar och tekniska utmaningar. Som ett resultat kontrollglas är särskilt viktiga. Vi har genererat kontroll bilder som består av olika vävnader från 1) Möss som bara var märkta med CldU,.. 2) Möss som bara var märkta med IDU;. 3) Möss som sekventiellt var märkta med CldU och sedan IDU,. 4) möss som sekventiellt var märkta i omvänd ordning, först med IDU och sedan CldU;. 5) Möss som hånar märkta med bara vatten. När lära sig etikett med CldU och IDU bör utredare utför alltid ut hela protokollet med alla 5 ovan uppsättningar av bilder från vävnaden av intresse. Lätt korsreaktivitet mellan CldU och injektionsmissbrukare är ett olyckligt men oundvikligt nackdelen med märkning med båda tymidinanaloger. Den CldU och IDU Tekniken bygger på skillnader i släktskap mellan antiserum som ursprungligen härrör mot BrdU i olika arter (mus och råtta). Vår protokoll, medan besvärligt, är utformad för att minimera dessa korsreaktivitet. Därför uppmanar vi försiktighet bland utredare som anser att hoppa över steget (er) i protokollet. Framför allt har vistött på problem med sekundär antisera som korsreaktivt mellan mus och råtta. Detta kan minimeras genom att använda Jackson antiserum som är fullständigt över adsorberade mellan mus och råtta. Vi misslyckas ibland för att adekvat upptäcka thymidinupptag. I sådana fall är det oerhört viktigt att använda positiva kontrollglas att avgöra vilket reagens eller steget inte fungerade. Svårigheterna är oftast på grund av dåligt alikvoter av antiserum, torr diabilder, eller otillräcklig kärnkraft permeabilization. Vi har misslyckats med att framgångsrikt etikett utveckla embryon med IDU. Således kan inte alla vävnader genomsläpplig för IDU. Alternativ till CldU och IDU för dubbel tymidinanalog märkning är vid horisonten. EDU (5-etinyl-2 deoxiuridin) kan vara ett substrat för koppar katalyseras klicka kemi upptäckt 10,11. Edu detektionsmetoder inte kräver separation av DNA-strängar, och är därmed mycket tillgängliga för analys med flödescytometri 12. Edu är förenlig men inte korsreaktivt med BrdU 10. Edu har använts för att kvantifiera cell omsättning av olika mus vävnader inklusive betaceller i bukspottkörteln 13, intestinal L celler 14 och Epidermis 15. Edu är ganska dyrt för tillfället ($ 1000 US per 500mg). Ändå verkar Edu upptäckt vara mycket mer känsliga än BrdU upptäckt 10. Således kan det vara ekonomiskt möjligt att kombinera EDU och BrdU istället för CldU och IDU. Denna metod kan också möjliggöra upptäckt av tre olika rundor av celldelning hos möss triply märkta för Edu, CldU och IDU. Sammanfattningsvis är vår teknik för sekventiell tymidinanalog märkning en ny metod för att upptäcka cell omsättning. Vi hoppas att vårt arbetssätt gör det möjligt för andra forskare att mer exakt kvantifiera celldelning, och räknar med att den kommer att öppna nya paradigm i vävnad homeostas.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>5-chloro-2-deoxyuridine (CldU)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MP Biomedical</td>
<td>0210547891</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>5-Iodo-2-deoxyuridine (IdU)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MP Biomedical</td>
<td>0210035701</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>4% Paraformaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>USB</td>
<td>19943</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10% Buffered Formalin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>23-427-098</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>XYLENES</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>EM-XX0060-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ethanol, Anhydrous (Histological)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>A405P-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS, 10X Powder Concentrate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>BP665-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton &#x2013;X-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>BP151-500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hydrochloric Acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>BDH3028-2.5LG</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Normal Donkey Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson ImmunoResearch</td>
<td>017-000-121</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mouse Anti BrdU</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Pharmingen</td>
<td>347580</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rat mab anti BrdU</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Accurate Chemical</td>
<td>OBT0030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cy2 donkey anti-rat</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson Immuno</td>
<td>712-225-153</td>
<td>Fully adsorbed secondaries from Jackson (minimal cross reactivity).</td>
</tr>
<tr>
<td>Cy5 donkey anti-mouse</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson immuno</td>
<td>715-175-151</td>
<td>See above</td>
</tr>
<tr>
<td>Glass Cover Slips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>C9056-1CS</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>YFP Filter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Chroma</td>
<td>49003 ET EYFP</td>
<td>Reduces auto-fluorescence in Cy2 channel</td>
</tr>
<tr>
<td>Cy3 Filter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Chroma</td>
<td>49004 ET Cy3</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cy5 Filter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Chroma</td>
<td>49006 ET Cy5</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ORCA ER Microscope Camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamamatsu</td>
<td>C4742-95-12ER</td>
<td>Excellent detection of fluorophores</td>
</tr>
<tr>
<td>ProLong Gold antifade reagent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>P36930</td>
<td>Do not use Vectashield (toxic to cyanine dyes).</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

immunofluorescent detection of two thymidine analogues (cldu and idu) in primary tissue

Noggrann mätning av celldelning är en grundläggande utmaning i den experimentella biologin som blir allt mer komplex när långsamt delande celler analyseras. Etablerade metoder för att upptäcka celldelning inkluderar direkt visualisering av kontinuerlig mikroskopi i cellkultur, spädning av avgörande färgämnen som carboxyfluorescein di-Aetate succinimidyl ester (CFSE), immuno-detektering av mitogena antigener som Ki67 eller PCNA, och analoger tymidin. Tymidinanaloger kan upptäckas genom en rad olika metoder inklusive radio-detektion för tritiated tymidin, immuno-detektering för bromo-deoxiuridin (BrdU), klor-deoxiuridin (CldU) och jod-deoxiuridin (IDU) och kemisk detektion för etinyl-deoxiuridin (EDU). Vi har härledda en strategi för att upptäcka sekventiell integrering av olika tymidinanaloger (CldU och IDU) i vävnader hos vuxna möss. Vår metod gör att utredarna att exakt kvantifiera två på varandra följande rundorna av celldelning. Genom att optimera immunfärgning protokoll vår metod kan upptäcka mycket låga analoger dos tymidin administreras via dricksvattnet, säker att administrera till möss under längre perioder. Därför kan vår teknik användas för att upptäcka cell omsättning i mycket långlivade vävnader. Optimal immunofluoresent färgning resultat kan uppnås i flera vävnadstyper, inklusive bukspottkörteln, hud, tarm, lever, binjurar, testiklar, äggstockar, sköldkörtel, lymfknutor, och hjärna. Vi har också tillämpat denna teknik för att identifiera onkogena omvandling inom vävnader. Vi har vidare tillämpat denna teknik för att avgöra om transit-förstärkning celler bidrar till tillväxt och förnyelse av vävnader. I denna mening representerar sekventiell tillförsel av tymidinanaloger en ny metod för att studera uppkomst och överlevnad av celler som deltar i vävnaden homeostas.

Watch this Scientific Journal Video about Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues CldU and IdU in Primary Tissue at JoVE.com

Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues CldU and IdU in Primary Tissue

Vi har härledda en strategi för att upptäcka sekventiell inkorporering av tymidinanaloger (CldU och IDU) i vävnader hos vuxna möss att kvantifiera två på varandra följande rundorna av celldelning. Denna strategi är användbar för att identifiera celler omsättning långlivade vävnader, onkogena omvandling eller transitering-förstärkning celler.

Immunofluorescens Upptäckt av två tymidinanaloger (CldU och IDU) i Primär Tissue

Accurate measurement of cell division is a fundamental challenge in experimental biology that becomes increasingly complex when slowly dividing cells are ...

Research

JoVE Journal

Biology

Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues (CldU and IdU) in Primary Tissue

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

Primär Kultur och Plasmid elektroporation av Murine organ Corti.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Isolering och Primär kultur av celler Rat Hepatiska

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

Isolering av primära Myofibroblaster från mus och Human Colon Tissue

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Improved Swiss-rolling Technique for Intestinal Tissue Preparation for Immunohistochemical and Immunofluorescent Analyses

Förbättrad Swiss-rullande Teknik för tarmvävnad Förberedelse för immunhistokemisk och immunofluorescens Analyser

Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current ...

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

I situ Immunofluorescerande färgning av autophagy i muskelstamceller

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal ...

Tissue Collection of Bats for -Omics Analyses and Primary Cell Culture

Vävnads insamling av fladdermöss för-omics-analyser och primär cell kultur

As high-throughput sequencing technologies advance, standardized methods for high quality tissue acquisition and preservation allow for the extension of ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

Microbiota analys med två steg PCR och nästa generations 16S rRNA Gene sekvensering

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

Apoptosis Induction and Detection in a Primary Culture of Sea Cucumber Intestinal Cells

Apoptos induktion och detektion i en primär kultur av hav gurka tarmceller

Primary cultured cells are used in a variety of scientific disciplines as exceptionally important tools for the functional evaluation of biological ...

Simple Detection of Primary Cilia by Immunofluorescence

Enkel Detektion av primär Cilier genom immunofluorescens

Primary cilia are dynamically regulated during cell cycle progression, specifically during the G0/G1 phases of the cell cycle, being resorbed prior to ...

Quantitative Proteomics Workflow using Multiple Reaction Monitoring Based Detection of Proteins from Human Brain Tissue

Kvantitativt proteomikarbetsflöde med hjälp av flera reaktionsövervakningsbaserade detektion av proteiner från mänsklig hjärnvävnad

The proteomic analysis of the human brain tissue over the last decade has greatly enhanced our understanding of the brain. However, brain related ...