Name: profiling of methyltransferases and other s-adenosyl-l-homocysteine-binding proteins by capture compound mass spectrometry (ccms)
Uploaded: 2010-12-20T16:20:00
Duration: 17 min 12 s
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这项工作是支持的人类前沿科学计划组织（HFSP奖2007年，RGP0058/2007-C）。我们感谢理查德罗伯茨教授发起的项目和富有成果的讨论。

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ThomasLenz，OliviaGrabner，MirkoGlinski，MathiasDreger，HubertKosterare受雇于caprotec bioanalytics有限责任公司，公司生产一些本文中使用的试剂。

以下的预防措施和意见，以下所述的协议时，可能是有用的：一）CCS的主要优势在于形成一个共价键之间的CC和MTase，因为这允许随后的严格​​的洗涤条件。共价交联是通过紫外线（310纳米以下）。引发一个光化学反应。正常开销的光线中含有的紫外线只有一小部分，但是，从较长的曝光开销甚至太阳的光控制和冷却照射在caproBox保护性SAH - CC的。 B）从中MTases被孤立的生物样品中可能含有蛋白质容易变性，因而它是强制性的，以保持冷却样品，并避免在任何时候都起泡。 C）caproBox冷却的样本，以0-4 ° C，在紫外线照射下发光的灯，然而，也放出热量。因此，这是必要的照射前的短暂离心瓶，所以坚持帽或小瓶墙壁的蛋白质不能形成降水种子。 d）如果再悬浮磁珠（如在清洗解决方案）可能不用手，在短期内申请样品放入超声波浴超声。 E）新鲜准备的0.2％TFA/60％乙腈溶液。我们发现，否则捕获的蛋白质可能无法从珠裂解。 F）归根到底是捕获的蛋白质进行的LC-MS/MS。质谱是一个高度敏感的方法。它是需要使用专门的LC - MS级试剂，在最后一个步骤（步骤2.11和进一步）。避免外部的蛋白质来源，例如角质，灰尘或从实验者的实验污染。尤其是在最后的消化步骤，它是建议要注意一个干净的工作空间，要戴手套和一个白大褂，可能一毛净，或理想的执行下一个洁净工作台的最后一个步骤。准备50毫米铵碳酸氢缓冲区LC MS级的水用于胰蛋白酶消化，过滤通过0.22μm的过滤器，分装，于-20 ° C存储，并使用每个等份，只有一次，以避免污染。胰蛋白酶溶液（测序级，罗氏，准备一个为0.5μg/μL的解决方案，通过增加1毫米盐酸冻干胰蛋白酶），可以储存在4 ° C几个星期。 G）为了获得可靠的质谱是必须有一个稳定喷雾ESI-MS/MS分析。 h）对于其他的LC-MS/MS比在本研究中所使用的系统，测量参数和肽识别算法必须单独调整。 下列修改可能与所描述的协议：A）或者释放ACN/0.2％TFA的60％（步长2.11）珠蛋白，这种蛋白质可以直接tryptically消化内珠悬浮（相同卷在步骤5.1），或进行SDS - PAGE，蛋白质可以公布的暂停和加热后收集到的95步骤2.9珠° C的SDS样品缓冲液中10分钟（两个，整个悬挂或只取上清液可装载进入凝胶的口袋）。我们发现的珠子珠胰蛋白酶消化过程中缓慢释放少量的聚合物水溶液的胰蛋白酶消化解决方案，即使经过多次水溶液洗涤步骤。聚合物污染的干扰MS肽识别，可以关闭使用80％乙腈（至少三次）珠洗净。珠80％的乙腈洗涤步骤后，应一次洗涤水前珠胰蛋白酶消化。 B）使用的链霉菌horseraddish过氧化物酶和ECL底物的免疫印迹，也可用于可视化的生物素含有消委会成功交联的蛋白质。因此，无论是步骤3.2后得到的凝胶可以被涂抹或，因为灵敏度比银染凝胶较高的约10倍，10步后，2.7μL的样品也可能是由免疫印迹分析。心灵endogeneously生物素蛋白，在后一种情况下，也可除了SAH - CC人为生物素的蛋白质检测。 c）我们发现，它取决于特殊的系统（裂解，解决靶蛋白，选择性和反应性的功能，他消委会），是否“离珠”的配置，交联反应之间自由CC和蛋白质在溶液中4或目前所描述的“珠”的配置（图1B）的性能更好。 在一般情况下，该方法也应兼容任何国家的稳定同位素的蛋白质或肽标签技术，2D凝胶电泳或捕获样本的评估。在“离珠”的配置，也可以捕捉到在整个细胞（未发表结果）的蛋白质。此外，药物或辅助因子的蛋白质结合位点，可概述MS肽测序的蛋白质序列内确定消委会紧密交联的位置。一种小分子的结合模式，以一种蛋白质，可以探索通过使用不同的C在选择性的功能和不同的连接器长度hemical附件立场。在目前的研究显示，还蛋白的蛋白质具有约束力的合作伙伴解决的选择性功能（PRMA基板RplK）或未知的小分子蛋白质相互作用（蛛网膜下腔出血来GlnA），可以识别。归纳总结，CCS，光交联反应的附加功能，允许从低丰度蛋白质或功能的蛋白质家族，具有灵敏度高的复杂的蛋白质混合物的分离和识别，并为科学家提供额外的工具，为研究小分子 - 蛋白质相互作用。

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		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
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<tr>
<td>SAH caproKit&trade;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>caprotec bioanalytics GmbH</td>
<td>1-1010-050 (50 reactions) 1-1010-010 (10 reactions)</td>
<td>Includes the SAH-CC, SAH competitor, streptavidin coated magnetic beads, capture buffer, and wash buffer</td>
</tr>
<tr>
<td>caproBox&trade;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>caprotec bioanalytics GmbH</td>
<td>1-5010-003 (110 V) 1-5010-004 (230 V)</td>
<td>For reproducible photo-activation while cooling the samples</td>
</tr>
<tr>
<td>caproMag&trade;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>caprotec bioanalytics GmbH</td>
<td>1-5100-001</td>
<td>For easy handling of magnetic particles without pipetting</td>
</tr>		</tbody>
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		</div>

profiling of methyltransferases and other s-adenosyl-l-homocysteine-binding proteins by capture compound mass spectrometry (ccms)

的方法有多种功能的小分子蛋白质的相互作用，如亲和层析1或2活动的蛋白质分析的基础上，以减少对蛋白质组的复杂性。三官能捕捉化合物（CCS，图1A）3是一种通用方法的基础上，在初始均衡驱动的一个小分子探针（选择性的功能，这里的S -腺苷- L -同型半胱氨酸，蛛网膜下腔出血，图1A）之间的相互作用和靶蛋白是不可逆转地固定在一个独立的光激活的反应功能（这里phenylazide）消委会与靶蛋白的表面之间光交联。排序功能（生物素）提供隔离的CC - 蛋白结合物从复杂生物混合物固相（这里的链霉亲和素磁珠）的帮助。实验的两个配置是可能的：“离珠”4或目前所描述的的“珠”的配置（图1B）。选择性功能，可几乎所有感兴趣的小分子（底物，抑制剂，药物分子）。 S -腺苷- L -蛋氨酸（SAM，图1A）是可能的，第二个ATP， 性质5，6，使用最广泛的辅助因子。它是用来作为主要的甲基集团捐助SAM依赖甲基（MTases），甲基化的DNA，RNA 的8，9蛋白质，或小分子 10催化化学反应的所有生物体。由于甲基化反应在不同生理情况下的关键作用（基因表达调控，表观遗传学，代谢），MTases分析可以预期，成为同样重要的功能蛋白质组学分析激酶。然而，他们的分析的分析工具，没有用。我们最近推出了CC与蛛网膜下腔出血选择性组，以填补这方面的技术差距（图1A）。 蛛网膜下腔出血，SAM的甲基转移后的产品，是一个已知的一般MTase 产品抑制剂11。出于这个原因，因为天然辅酶SAM是进一步转移的辅助因子的其他部分或启动以及自由基反应的酶， 由于其化学不稳定12，蛛网膜下腔出血是一个理想的选择性功能，为CC目标MTases。在这里，我们报告的分析MTases和其他SAH的结合蛋白从大肠杆菌（大肠杆菌），最好的特点原核生物之一，这已作为首选机型的菌株DH5αSAH - CC和CCMS系统工具在无数的生化，生物，和生物技术研究的有机体。光活化交联，提高产量和敏感性实验，可以很容易地在竞争实验，使用免费蛛网膜下腔出血超过测试和特异性。

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Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry CCMS

捕获化合物三官能团的小分子功能可逆的光交联和净化的小分子蛋白质的相互作用，以减少蛋白质组的复杂性。在这里，我们使用捕捉化合物<em&gt; S</em&gt;腺苷<sub&gt; L</sub&gt;同型半胱氨酸具有约束力的选择性功能，从一个孤立的甲基化<em&gt;大肠埃希氏菌</em&gt;全细胞裂解液，并确定由MS。

分析甲基化和其他 S腺苷 L</sub捕捉复合质谱（CCMS）>同型半胱氨酸结合蛋白

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