Name: profiling of methyltransferases and other s-adenosyl-l-homocysteine-binding proteins by capture compound mass spectrometry (ccms)
Uploaded: 2010-12-20T16:20:00
Duration: 17 min 12 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry CCMS at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door de Human Frontier Science Program Organization (HFSP Award 2007, RGP0058/2007-C). Wij danken prof. dr. Richard Roberts voor het initiëren van het project en voor de vruchtbare discussies.

<ol>
	<li>Katayama, H., Oda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+proteomics+for+drug+discovery+based+on+compound-immobilized+affinity+chromatography.">Chemical proteomics for drug discovery based on compound-immobilized affinity chromatography.</a> J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 855, 21-27 (2007).</li><li>Barglow, K. T., Cravatt, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-based+protein+profiling+for+the+functional+annotation+of+enzymes.">Activity-based protein profiling for the functional annotation of enzymes.</a> Nat. Methods. 4, 822-827 (2007).</li><li>Koster, H., Little, D. P., Luan, P., Muller, R., Siddiqi, S. M., Marappan, S., Yip, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capture+compound+mass+spectrometry:+a+technology+for+the+investigation+of+small+molecule+protein+interactions.">Capture compound mass spectrometry: a technology for the investigation of small molecule protein interactions.</a> Assay Drug Dev. Technol. 5, 381-390 (2007).</li><li>Dalhoff, C., Hueben, M., Lenz, T., Poot, P., Nordhoff, E., Koster, H., Weinhold, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+S-Adenosyl-L-homocysteine+Capture+Compounds+for+Selective+Photoinduced+Isolation+of+Methyltransferases.">Synthesis of S-Adenosyl-L-homocysteine Capture Compounds for Selective Photoinduced Isolation of Methyltransferases.</a> ChemBioChem. 11, 256-265 (2010).</li><li>Lu, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S-Adenosylmethionine.">S-Adenosylmethionine.</a> Int. J. Biochem. Cell. Biol. 32, 391-3952 (2000).</li><li>Cantoni, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+methylation:+selected+aspects.">Biological methylation: selected aspects.</a> Annu. Rev. Biochem. 44, 435-451 (1975).</li><li>Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+Watson+and+Crick:+DNA+methylation+and+molecular+enzymology+of+DNA+methyltransferases.">Beyond Watson and Crick: DNA methylation and molecular enzymology of DNA methyltransferases.</a> ChemBioChem. 3, 274-293 (2002).</li><li>Chow, C. S., Lamichhane, T. N., Mahto, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+nucleotide+repertoire+of+the+ribosome+with+post-transcriptional+modifications.">Expanding the nucleotide repertoire of the ribosome with post-transcriptional modifications.</a> ACS Chem. Biol. 2, 610-619 (2007).</li><li>Grillo, M. A., Colombatto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S-Adenosylmethionine+and+protein+methylation.">S-Adenosylmethionine and protein methylation.</a> Amino Acids. 28, 357-362 (2005).</li><li>Fujioka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+small+molecule+methyltransferases:+their+structural+and+functional+features.">Mammalian small molecule methyltransferases: their structural and functional features.</a> Int. J. Biochem. 24, 1917-1924 (1992).</li><li>Borchardt, R. T., Salvatore, F., Borek, E., Zappia, V., Williams-Ashman, H. G., Schlenk, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Biochemistry of S-Adenosylmethionine. , 151-171 (1977).</li><li>Hoffman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatographic+analysis+of+the+chiral+and+covalent+instability+of+S-adenosyl-l-methionine.">Chromatographic analysis of the chiral and covalent instability of S-adenosyl-l-methionine.</a> Biochemistry. 25, 4444-4449 (1986).</li><li>Keller, A., Nesvizhskii, A. I., Kolker, E., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Empirical+statistical+model+to+estimate+the+accuracy+of+peptide+identifications+made+by+MS/MS+and+database+search.">Empirical statistical model to estimate the accuracy of peptide identifications made by MS/MS and database search.</a> Anal. Chem. 74, 5383-5392 (2002).</li><li>Nesvizhskii, A. I., Keller, A., Kolker, E., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+statistical+model+for+identifying+proteins+by+tandem+mass+spectrometry.">A statistical model for identifying proteins by tandem mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 75, 4646-4658 (2003).</li></ol>

ThomasLenz, OliviaGrabner, MirkoGlinski, MathiasDreger, en HubertKosterare in dienst van caprotec bioanalytics GmbH, Inc dat sommige van de gebruikte reagentia in dit artikel oplevert.

De volgende voorzorgsmaatregelen en opmerkingen kunnen nuttig zijn bij het volgen van het beschreven protocol: a) Een groot voordeel van CCS ligt in de vorming van een covalente binding tussen de CC en de MTase, omdat dit toelaat de volgende stringente wasomstandigheden. De covalente crosslink wordt bereikt door een fotoreactie veroorzaakt door UV-licht (310 nm max.). Normale overhead licht bevat slechts een kleine fractie van de UV, echter, de bescherming van de SAH-CC van langere blootstelling aan overhead of zelfs zonlicht tot de gecontroleerde en afgekoeld bestraling in de caproBox. b) De biologische monsters waaruit de MTases moeten worden geïsoleerd bevatten eiwitten die gevoelig zijn voor denaturatie, daarom is het verplicht om de monsters koel en om te voorkomen dat schuim op alle tijden. c) De caproBox koelt de monsters naar 0-4 ° C, de lampen die zo UV-licht, echter ook warmte uitstralen. Daarom is het noodzakelijk om in het kort de vaatjes voor de bestraling, zodat eiwitten zich te houden aan de doppen of injectieflacon wanden kunnen geen neerslag zaden. d) Indien re-schorsing van het magnetische korrels (bijvoorbeeld in de wasoplossingen) is niet mogelijk met de hand, kort van toepassing echo door het plaatsen van de monsters in een ultrasoon bad. e) vers bereiden de 0,2% TFA/60% ACN-oplossing. We vonden dat anders de gevangen eiwitten niet kan worden gesplitst van de kralen. f) De uiteindelijke analyse van de gevangen eiwitten wordt uitgevoerd door LC-MS/MS. Massaspectrometrie is een zeer gevoelige methode. Het is noodzakelijk om uitsluitend LC-MS kwaliteit reagentia te gebruiken in de laatste stappen (stap 2.11 en verder). Verontreiniging van de experimenten door externe bronnen van eiwit, bijvoorbeeld keratine die afkomstig zijn van stof of van de experimentator. Vooral tijdens de laatste spijsvertering stappen, is het raadzaam om aandacht te besteden aan een schone werkplek, om handschoenen en een laboratoriumjas en eventueel een haarnet dragen of ideaal voer de laatste stappen in een schone bank. Bereid de 50 mM ammoniumbicarbonaat buffer gebruikt voor tryptische digest in LC MS kwaliteit water, filteren door middel van 0,22 urn filter, aliquoot, bewaren bij -20 ° C, en gebruiken elk aliquot slechts een keer aan verontreinigingen te voorkomen. De trypsine oplossing (sequencing rang, Roche, bereiden een 0,5 ug / ul-oplossing door het toevoegen van 1 mM HCl tot gevriesdroogde trypsine) kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende enkele weken. g) Voor het verkrijgen van betrouwbare massa spectra is het essentieel te beschikken over een stabiele spray in ESI-MS/MS analyse. h) Voor andere LC-MS/MS systemen dan degene gebruikt in de huidige studie, moeten meten parameters en peptide identificatie algoritmen individueel aangepast worden. De volgende wijzigingen mogelijk zijn met betrekking tot de beschreven protocol: a) Als alternatief voor het vrijgeven van de eiwitten van de kralen met 60% ACN/0.2% TFA (stap 2.11), kunnen de eiwitten tryptically direct worden verteerd in een kraal suspensie (dezelfde volumes als in stap 5.1) of, voor SDS-PAGE, kunnen de eiwitten worden vrijgegeven door schorsing en het verwarmen van de kralen verzameld na stap 2.9 tot 95 ° C gedurende 10 min in SDS sample buffer (zowel de volledige schorsing of alleen het supernatant kan worden geladen in de gel zak). Wij vonden dat de kralen langzaam kleine hoeveelheden polymeer introductie in de waterige oplossing tryptische verteren tijdens de on-bead tryptische verteren, zelfs na een aantal waterige wassen stappen. Het polymeer besmetting interfereert met MS peptide identificatie en kunnen gewassen uit de beads met 80% ACN (minstens drie keer). Na de 80% ACN wasstappen, moet de kralen een keer worden gewassen met water voorafgaand aan de on-bead tryptische verteren. b) de Western blots met behulp van streptavidine-peroxidase horseraddish en ECL substraat kan ook gebruikt worden om succesvol verknoping van de biotine met CC te visualiseren aan de eiwitten. Daarom, ofwel de gel verkregen na stap 3.2 kan worden uitgewist of, omdat de gevoeligheid is ongeveer een factor 10 hoger dan zilverkleuring van gels, kan 10 pi monsters na stap 2.7 ook worden geanalyseerd door western blot. Let erop dat in het laatste geval endogeneously gebiotinyleerd eiwitten ook worden gedetecteerd naast de eiwitten kunstmatig gebiotinyleerde door de SAH-CC. c) We vonden dat het afhangt van de bijzondere regeling (lysaat, gericht doeleiwitten, selectiviteit en reactiviteit functie van hij CC), of de &quot;off-hiel&quot; configuratie, waar de verknopingsreactie plaatsvindt tussen vrije CC en eiwit in oplossing 4 of de thans beschreven &quot;on-bead&quot; configuratie (Figuur 1B) beter presteert. In het algemeen moet de methode ook compatibel met alle state-of-the-art stabiele isotoop eiwit of peptide labeling technologie, of de beoordeling van de capture monster door 2D-gelelektroforese. In de &quot;off-bead&quot; configuratie, is het ook mogelijk om eiwitten te vangen binnen het gehele cellen (niet-gepubliceerde resultaten). Bovendien kan het geneesmiddel of cofactor bindingsplaats van een eiwit worden geschetst door het bepalen van de close-door verknoping positie van de CC in de eiwitsequentie door MS peptide sequencing. De binding modus van een klein molecuul aan een eiwit kan worden onderzocht door het gebruik van verschillende cCHEMISCHE bevestiging functies bij de selectiviteit functie en verschillende linker lengtes. Zoals te zien is in de huidige studie, ook eiwitbinding partners van de eiwitten aangepakt door de selectiviteit functie (RplK als substraat van PrmA) of onbekende klein molecuul eiwit interacties (SAH naar GlnA) kunnen worden geïdentificeerd. Samengevat, de extra functie van de CCS, de foto-crosslinking reactiviteit, zorgt voor de isolatie en identificatie van laag overvloedige eiwitten of functionele eiwit families van complexe eiwitmengsels met een hoge gevoeligheid en biedt wetenschappers met een extra instrument voor het bestuderen van kleine molecule - eiwit interacties .

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>SAH caproKit&trade;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>caprotec bioanalytics GmbH</td>
<td>1-1010-050 (50 reactions) 1-1010-010 (10 reactions)</td>
<td>Includes the SAH-CC, SAH competitor, streptavidin coated magnetic beads, capture buffer, and wash buffer</td>
</tr>
<tr>
<td>caproBox&trade;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>caprotec bioanalytics GmbH</td>
<td>1-5010-003 (110 V) 1-5010-004 (230 V)</td>
<td>For reproducible photo-activation while cooling the samples</td>
</tr>
<tr>
<td>caproMag&trade;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>caprotec bioanalytics GmbH</td>
<td>1-5100-001</td>
<td>For easy handling of magnetic particles without pipetting</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

profiling of methyltransferases and other s-adenosyl-l-homocysteine-binding proteins by capture compound mass spectrometry (ccms)

Er is een verscheidenheid van benaderingen om de complexiteit van het proteoom te verminderen op basis van functionele kleine moleculen-eiwit interacties, zoals affiniteitschromatografie een of Activity Based Protein Profiling 2. Trifunctionele Capture Compounds (CCS, figuur 1A) drie vormen de basis voor een generieke aanpak, waarbij de initiële evenwicht gedreven interactie tussen een klein molecuul sonde (de selectiviteit functie, hier S-adenosyl-L-homocysteine, SAH, figuur 1A) en doeleiwitten is onomkeerbaar vast op foto-crosslinking tussen een onafhankelijke foto-activable reactiviteit functie (hier een phenylazide) van de CC en het oppervlak van het doel eiwitten. De sorteerfunctie (hier biotine) dient om de CC te isoleren - eiwit conjugaten van complexe biologische mengsels met behulp van een vaste fase (hier streptavidine magnetische korrels). Twee configuraties van de experimenten zijn mogelijk: &quot;off-bead&quot; 4 of de thans wordt beschreven &quot;on-bead&quot; configuratie (Figuur 1B). De selectiviteit functie kan vrijwel elke kleine molecule van belang (substraten, remmers, medicijn-moleculen) zijn. S-adenosyl-L-methionine (SAM, Figuur 1A) is waarschijnlijk, tweede tot en ATP, het meest gebruikte cofactor in de natuur 5, 6. Het wordt gebruikt als de voornaamste methylgroep donor in alle levende organismen met de chemische reactie wordt gekatalyseerd door SAM-afhankelijke-methyl (MTases), die DNA 7, 8 RNA, eiwitten 9, of kleine moleculen 10 methylaat. Gezien de cruciale rol van de methylatie reacties in diverse fysiologische scenario&#39;s (genregulatie, epigenetica, metabolisme), kan de profilering van MTases worden naar verwachting van even groot belang in functionele proteomics als de profilering van kinases. Analytische hulpmiddelen voor hun profilering, echter, zijn niet beschikbaar. We hebben onlangs een CC met SAH als selectiviteit groep deze technologische kloof (Figuur 1A) te vullen. SAH, het product van SAM na methyl overdracht, is een bekend algemeen MTase product inhibitor 11. Om deze reden en omdat de natuurlijke cofactor SAM wordt gebruikt door meer enzymen overdracht van andere delen van de cofactor of het initiëren van radicale reacties als gevolg van de chemische instabiliteit 12, SAH is een ideale functie voor selectiviteit een CC naar MTases doel. Hier melden wij het ​​nut van de SAH-CC en CCMS door profilering MTases en andere SAH-bindende eiwitten uit de stam DH5a van Escherichia coli (E. coli), een van de best gekarakteriseerd prokaryoten, die gediend heeft als de gewenste model organisme in talloze biochemische, biologische en biotechnologische studies. Foto-geactiveerde verknoping verbetert de opbrengst en de gevoeligheid van het experiment, en de specificiteit kan gemakkelijk worden getest in competitie experimenten met een overmaat aan vrije SAH.

Watch this Scientific Journal Video about Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry CCMS at JoVE.com

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry CCMS

Capture Verbindingen zijn trifunctionele kleine moleculen om de complexiteit van het proteoom te verminderen door functionele omkeerbare klein molecuul-eiwit interacties, gevolgd door foto-crosslinking en zuivering. Hier gebruiken we een Capture Compound met<em&gt; S</em&gt;-Adenosyl-<sub&gt; L</sub&gt;-Homocysteine-bindende als selectiviteit functie om methyl-isoleren van een<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Hele cellysaat en identificeren hen door MS.

Profilering van methyl-en andere S-Adenosyl- L-Homocysteine-bindende eiwitten door Capture Compound-massaspectrometrie (CCMS)

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity ...

Research

JoVE Journal

Biology

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS)

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

MALDI Monstervoorbereiding: de Ultra Thin Layer methode

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Antibody Profiling by Luciferase Immunoprecipitation Systems (LIPS)

Antibody Profiling by Luciferase Immunoprecipitation Systems LIPS

Antilichaam Profiling door Luciferase Immunoprecipitatie Systems (LIPS)

Technologies for comprehensively understanding and quantifying antibody profiles to autoantigens and infectious agents may yield new insights into disease ...

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Het analyseren van grote eiwitcomplexen de Structuurfondsen massaspectrometrie

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

OLIgo Mass Profiling (OLIMP) of Extracellular Polysaccharides

OLIgo Mass Profiling OLIMP of Extracellular Polysaccharides

Oligo Mass Profiling (Olimp) van extracellulaire polysacchariden

The direct contact of cells to the environment is mediated in many organisms by an extracellular matrix. One common aspect of extracellular matrices is ...

Atmospheric-pressure Molecular Imaging of Biological Tissues and Biofilms by LAESI Mass Spectrometry

Atmosferische druk moleculaire beeldvorming van biologische weefsels en biofilms door LAESI massaspectrometrie

Ambient ionization methods in mass spectrometry allow analytical investigations to be performed directly on a tissue or biofilm under native-like ...

Direct Analysis of Single Cells by Mass Spectrometry at Atmospheric Pressure

Directe analyse van enkele cellen met behulp van massaspectrometrie bij atmosferische druk

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

Kwantificering van eiwitten met behulp van immuno-peptide Verrijking gekoppeld aan massaspectrometrie

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry

Profilering Thiol Redox Proteome Met behulp van Isotope Tagging massaspectrometrie

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on ...

Capture Compound Mass Spectrometry - A Powerful Tool to Identify Novel c-di-GMP Effector Proteins

Capture Compound Massaspectrometrie - een krachtig hulpmiddel om het identificeren van nieuwe c-di-GMP effectoreiwitten

Considerable progress has been made during the last decade towards the identification and characterization of enzymes involved in the synthesis ...

Sequence-specific Labeling of Nucleic Acids and Proteins with Methyltransferases and Cofactor Analogues

Sequentie-specifieke Labeling van nucleïnezuren en eiwitten met methyltransferases en Cofactor Analogues

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific ...