Name: profiling of methyltransferases and other s-adenosyl-l-homocysteine-binding proteins by capture compound mass spectrometry (ccms)
Uploaded: 2010-12-20T16:20:00
Duration: 17 min 12 s
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Ce travail a été soutenu par l&#39;Organisation Human Frontier Science Program (HFSP Award 2007, RGP0058/2007-C). Nous tenons à remercier le professeur Richard Roberts pour amorcer le projet et pour des discussions fructueuses.

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ThomasLenz, OliviaGrabner, MirkoGlinski, MathiasDreger et HubertKosterare employées par caprotec bioanalytique GmbH, Inc qui produit certains des réactifs utilisés dans cet article.

Les précautions suivantes et les commentaires peuvent être utiles quand on suit le protocole décrit: a) Un avantage majeur du CC réside dans la formation d&#39;une liaison covalente entre le CC et le MTase, car cela permet subséquente des conditions de lavage rigoureux. La réticulation covalente est réalisée par un photoréaction déclenchée par la lumière UV (310 nm max.). Plafonnier normal contient seulement une petite fraction des rayons UV, toutefois, de protéger le SEP-CC de plus l&#39;exposition au rétroprojecteur ou la lumière, même lever du soleil, à l&#39;irradiation contrôlée et refroidi dans le caproBox. b) Les échantillons biologiques à partir desquels l&#39;MTases doivent être isolés peuvent contenir des protéines susceptibles de dénaturation, par conséquent, il est obligatoire de conserver les échantillons frais et d&#39;éviter de faire mousser à tout moment. c) Le caproBox refroidit les échantillons à 0-4 ° C, les lampes émettant de la lumière UV, cependant, émettent également de la chaleur. Par conséquent, il est nécessaire de centrifuger brièvement les flacons avant l&#39;irradiation, donc des protéines en respectant les plafonds ou les murs flacon ne peuvent pas former des graines de précipitation. d) Si la remise en suspension des billes magnétiques (par exemple dans les solutions de lavage) n&#39;est pas possible à la main, peu applicables à ultrasons en plaçant les échantillons dans un bain à ultrasons. e) fraîchement préparer la solution d&#39;ACN 0,2% TFA/60%. Nous avons constaté que les protéines capturées contraire ne peut être clivée de la perles. f) L&#39;analyse finale des protéines capturées est réalisée par LC-MS/MS. La spectrométrie de masse est une méthode hautement sensible. Il est nécessaire d&#39;utiliser des réactifs exclusivement LC-MS de qualité dans les étapes finales (étape 2.11 et plus). Eviter la contamination des expériences par des sources de protéines externes, la kératine, par exemple en provenance de la poussière ou de l&#39;expérimentateur. Particulièrement au cours des étapes de digestion finale, il est recommandé de faire attention à un espace de travail propre, de porter des gants et une blouse de laboratoire et, éventuellement, un filet à cheveux ou idéalement exécuter les étapes finales sous un banc propre. Préparer le tampon de 50 mM de bicarbonate d&#39;ammonium utilisé pour digestion trypsique en LC MS eau de qualité, filtrer à travers filtre de 0,22 um, aliquote, conserver à -20 ° C, et utiliser chaque aliquote qu&#39;une seule fois pour éviter les contaminations. La solution de trypsine (séquençage de grade, Roche, préparer un g 0,5 / ul solution en ajoutant HCl 1 mM d&#39;lyophilisé trypsine) peuvent être conservés à 4 ° C pendant plusieurs semaines. g) Pour obtenir des spectres de masse fiable, il est essentiel d&#39;avoir un spray stable dans l&#39;analyse ESI-MS/MS. h) Pour les systèmes LC-MS/MS autre que celui utilisé dans la présente étude, les paramètres de mesure et d&#39;algorithmes d&#39;identification de peptides doivent être ajustés individuellement. Les modifications suivantes sont possibles en ce qui concerne le protocole décrit: a) Comme alternative à la libération des protéines à partir des billes par du TFA 60% ACN/0.2% (étape 2.11), les protéines peuvent être directement tryptically digérés dans un suspension de billes (mêmes volumes que à l&#39;étape 5.1) ou, pour SDS-PAGE, les protéines peuvent être libérés par la suspension et le chauffage des perles recueillies après l&#39;étape de 2,9 à 95 ° C pendant 10 min dans du tampon échantillon de SDS (à la fois, la suspension totale ou seulement le surnageant peut être chargé dans la poche de gel). Nous avons constaté que les billes de libérer lentement de petites quantités de polymère dans la solution aqueuse digérer tryptique cours sur billes digérer tryptique même après plusieurs étapes de lavage aqueux. La contamination de polymères interfère avec MS peptide d&#39;identification et peuvent être lavés les perles avec 80% d&#39;ACN (au moins trois fois). Après les étapes de lavage de 80% d&#39;ACN, les billes doivent être lavés une fois avec de l&#39;eau avant de le digérer tryptique-billes. b) Western blot à l&#39;aide de streptavidine-peroxydase et le substrat horseraddish ECL peut également être utilisé pour visualiser réticulation succès du CC biotine contenant les protéines. Par conséquent, soit le gel obtenu après l&#39;étape 3.2 peut être effacé ou, parce que la sensibilité est environ 10 fois plus élevé que coloration à l&#39;argent de gels, de 10 échantillons ul après l&#39;étape 2.7 peut également être analysée par western blot. L&#39;esprit que dans ce dernier cas protéines biotinylées endogeneously seront également détectés en dehors des protéines biotinylées artificiellement par le SEP-CC. c) Nous avons constaté que cela dépend du système spécial (lysat, adressée protéines cibles, la sélectivité et la fonction qu&#39;il réactivité de CC), si le &quot;hors-talon&quot; de configuration, où la réaction de réticulation a lieu entre CC libres et des protéines en solution à 4 ou l&#39;présentement décrit &quot;sur-talon&quot; de configuration (figure 1B) fonctionne mieux. En général, la méthode doit également être compatible avec n&#39;importe quel état de la protéine d&#39;isotopes stables ou l&#39;art technologie d&#39;étiquetage peptide, ou une évaluation de l&#39;échantillon capture par électrophorèse en gel 2D. Dans le &quot;off-talon&quot; de configuration, il est également possible de capturer des protéines dans des cellules entières (résultats non publiés). Par ailleurs, le médicament ou le site cofacteur liaison d&#39;une protéine peut être décrite par la détermination de la position de réticulation de près par le CC dans la séquence protéique par MS séquençage peptidique. Le mode de fixation d&#39;une petite molécule d&#39;une protéine peut être explorée en utilisant différentes cpositions de fixation CHIMIQUE à la fonction de sélectivité et de différentes longueurs de liaison. Comme indiqué dans la présente étude, les partenaires de la protéine lie également des protéines traitées par la fonction de sélectivité (RplK comme substrat du PRMA) ou inconnus petites interactions protéine molécule (HSA au glnA) peuvent être identifiés. Résumé, la caractéristique supplémentaire de la CCS, la réactivité de photo-réticulation, permet à l&#39;isolement et l&#39;identification de protéines de faible abondance ou de familles de protéines fonctionnelles à partir de mélanges complexes de protéines avec une sensibilité élevée et fournit aux scientifiques un outil supplémentaire pour l&#39;étude de petites molécules - les interactions entre protéines .

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>SAH caproKit&trade;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>caprotec bioanalytics GmbH</td>
<td>1-1010-050 (50 reactions) 1-1010-010 (10 reactions)</td>
<td>Includes the SAH-CC, SAH competitor, streptavidin coated magnetic beads, capture buffer, and wash buffer</td>
</tr>
<tr>
<td>caproBox&trade;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>caprotec bioanalytics GmbH</td>
<td>1-5010-003 (110 V) 1-5010-004 (230 V)</td>
<td>For reproducible photo-activation while cooling the samples</td>
</tr>
<tr>
<td>caproMag&trade;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>caprotec bioanalytics GmbH</td>
<td>1-5100-001</td>
<td>For easy handling of magnetic particles without pipetting</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

profiling of methyltransferases and other s-adenosyl-l-homocysteine-binding proteins by capture compound mass spectrometry (ccms)

Il ya une variété d&#39;approches pour réduire la complexité du protéome sur la base de petites molécules fonctionnelles interactions protéine-telles que la chromatographie d&#39;affinité ou d&#39;une protéine de profilage Activity Based 2. Composés de capture trifonctionnelle (CC, figure 1A) 3 sont à la base d&#39;une approche générique, dans lequel l&#39;équilibre initial axé sur l&#39;interaction entre une sonde petite molécule (la fonction de sélectivité, ici S-adénosyl-L-homocystéine, HSA, figure 1A) et les protéines cibles est irréversiblement fixée sur la photo-réticulation entre une fonction de réactivité photo activables indépendante (ici un phénylazide) du CC et la surface des protéines cibles. La fonction de tri (ici biotine) sert à isoler le CC - conjugués de protéines à partir de mélanges complexes biologiques à l&#39;aide d&#39;une phase solide (ici des billes de streptavidine magnétique). Deux configurations de ces expériences sont possibles: &quot;off-talon&quot; 4 ou le décrit présentement «sur-talon&quot; de configuration (figure 1B). La fonction de sélectivité peut être pratiquement n&#39;importe quelle petite molécule d&#39;intérêt (substrats, inhibiteurs, des molécules de médicaments). S-adénosyl-L-méthionine (SAM, figure 1A) est probablement, la deuxième à l&#39;ATP, le cofacteur le plus largement utilisé dans la nature 5, 6. Il est utilisé comme donneur de groupe méthyle majeur dans tous les organismes vivants avec la réaction chimique catalysée par SAM-dépendante méthyltransférases (MTases), qui méthylate 7 de l&#39;ADN, l&#39;ARN 8, 9 protéines, ou des petites molécules 10. Étant donné le rôle crucial des réactions de méthylation dans divers scénarios physiologiques (la régulation des gènes, l&#39;épigénétique, le métabolisme), le profilage des MTases peut être appelé à devenir d&#39;une importance similaire dans la protéomique fonctionnelle le profilage de kinases. Des outils analytiques pour leur profilage, cependant, n&#39;ont pas été disponibles. Nous avons récemment introduit un CC avec HSA en tant que groupe de sélectivité pour combler ce fossé technologique (figure 1A). HSA, le produit de la SAM après le transfert de méthyle, est un inhibiteur général des produits connus MTase 11. Pour cette raison et parce que le naturel cofacteur SAM est utilisé par d&#39;autres enzymes de transférer d&#39;autres parties du cofacteur ou initier des réactions radicalaires ainsi qu&#39;en raison de son instabilité chimique 12, SEP est une fonction de sélectivité idéale pour un CC de cibler MTases. Nous rapportons ici l&#39;utilité de la SAH-CC et CCMS par MTases profilage et d&#39;autres protéines liant l&#39;HSA de la souche DH5a d&#39;Escherichia coli (E. coli), l&#39;un des mieux caractérisés les procaryotes, qui a servi de modèle préféré organisme dans d&#39;innombrables études biochimiques, biologiques et biotechnologiques. Photo-activé réticulation améliore le rendement et la sensibilité de l&#39;expérience, et la spécificité peuvent être facilement testés dans des expériences de compétition en utilisant un excès du libre HSA.

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Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry CCMS

Composés de capture sont trifonctionnel petites molécules afin de réduire la complexité du protéome par fonctionnels réversibles petite molécule de protéine d&#39;interaction suivie par la photo-réticulation et de purification. Ici, nous utilisons un composé de capture avec des<em&gt; S</em&gt;-Adénosyl-<sub&gt; L</sub&gt;-Homocystéine-contraignante que la fonction de sélectivité pour isoler méthyltransférases d&#39;un<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Cellule entière lysat et les identifier par la SP.

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