Name: profiling of methyltransferases and other s-adenosyl-l-homocysteine-binding proteins by capture compound mass spectrometry (ccms)
Uploaded: 2010-12-20T16:20:00
Duration: 17 min 12 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry CCMS at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי ארגון Human תוכנית Frontier Science (פרס HFSP 2007, RGP0058/2007-C). אנו מודים פרופ &#39;ריצ&#39;רד רוברטס ליזום את הפרויקט לדיונים פוריים.

<ol>
	<li>Katayama, H., Oda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+proteomics+for+drug+discovery+based+on+compound-immobilized+affinity+chromatography.">Chemical proteomics for drug discovery based on compound-immobilized affinity chromatography.</a> J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 855, 21-27 (2007).</li><li>Barglow, K. T., Cravatt, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-based+protein+profiling+for+the+functional+annotation+of+enzymes.">Activity-based protein profiling for the functional annotation of enzymes.</a> Nat. Methods. 4, 822-827 (2007).</li><li>Koster, H., Little, D. P., Luan, P., Muller, R., Siddiqi, S. M., Marappan, S., Yip, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capture+compound+mass+spectrometry:+a+technology+for+the+investigation+of+small+molecule+protein+interactions.">Capture compound mass spectrometry: a technology for the investigation of small molecule protein interactions.</a> Assay Drug Dev. Technol. 5, 381-390 (2007).</li><li>Dalhoff, C., Hueben, M., Lenz, T., Poot, P., Nordhoff, E., Koster, H., Weinhold, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+S-Adenosyl-L-homocysteine+Capture+Compounds+for+Selective+Photoinduced+Isolation+of+Methyltransferases.">Synthesis of S-Adenosyl-L-homocysteine Capture Compounds for Selective Photoinduced Isolation of Methyltransferases.</a> ChemBioChem. 11, 256-265 (2010).</li><li>Lu, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S-Adenosylmethionine.">S-Adenosylmethionine.</a> Int. J. Biochem. Cell. Biol. 32, 391-3952 (2000).</li><li>Cantoni, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+methylation:+selected+aspects.">Biological methylation: selected aspects.</a> Annu. Rev. Biochem. 44, 435-451 (1975).</li><li>Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+Watson+and+Crick:+DNA+methylation+and+molecular+enzymology+of+DNA+methyltransferases.">Beyond Watson and Crick: DNA methylation and molecular enzymology of DNA methyltransferases.</a> ChemBioChem. 3, 274-293 (2002).</li><li>Chow, C. S., Lamichhane, T. N., Mahto, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+nucleotide+repertoire+of+the+ribosome+with+post-transcriptional+modifications.">Expanding the nucleotide repertoire of the ribosome with post-transcriptional modifications.</a> ACS Chem. Biol. 2, 610-619 (2007).</li><li>Grillo, M. A., Colombatto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S-Adenosylmethionine+and+protein+methylation.">S-Adenosylmethionine and protein methylation.</a> Amino Acids. 28, 357-362 (2005).</li><li>Fujioka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+small+molecule+methyltransferases:+their+structural+and+functional+features.">Mammalian small molecule methyltransferases: their structural and functional features.</a> Int. J. Biochem. 24, 1917-1924 (1992).</li><li>Borchardt, R. T., Salvatore, F., Borek, E., Zappia, V., Williams-Ashman, H. G., Schlenk, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Biochemistry of S-Adenosylmethionine. , 151-171 (1977).</li><li>Hoffman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatographic+analysis+of+the+chiral+and+covalent+instability+of+S-adenosyl-l-methionine.">Chromatographic analysis of the chiral and covalent instability of S-adenosyl-l-methionine.</a> Biochemistry. 25, 4444-4449 (1986).</li><li>Keller, A., Nesvizhskii, A. I., Kolker, E., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Empirical+statistical+model+to+estimate+the+accuracy+of+peptide+identifications+made+by+MS/MS+and+database+search.">Empirical statistical model to estimate the accuracy of peptide identifications made by MS/MS and database search.</a> Anal. Chem. 74, 5383-5392 (2002).</li><li>Nesvizhskii, A. I., Keller, A., Kolker, E., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+statistical+model+for+identifying+proteins+by+tandem+mass+spectrometry.">A statistical model for identifying proteins by tandem mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 75, 4646-4658 (2003).</li></ol>

ThomasLenz, OliviaGrabner, MirkoGlinski, MathiasDreger ו HubertKosterare המועסקים על ידי caprotec bioanalytics GmbH, Inc המייצרת כמה חומרים כימיים המשמשים במאמר זה.

אמצעי הזהירות הבאים והערות עשוי להיות שימושי כאשר בעקבות פרוטוקול תיאר: א) היתרון העיקרי של CCS טמון ביצירת קשר קוולנטי בין CC לבין MTase, כמו זה היתרי התנאים הבאים כביסה מחמירים. Crosslink קוולנטיים מושגת על ידי photoreaction מופעלות על ידי אור אולטרה סגול (310 ננומטר מקסימום.). אור המנורה רגיל מכיל רק חלק קטן של UV, לעומת זאת, להגן על אדון-CC מחשיפה עוד תקורה או אור השמש אפילו עד הקרנה מבוקרת מקורר caproBox. ב) דגימות ביולוגיות שממנו MTases הם להיות מבודדים עשויים להכיל חלבונים נוטים denaturation, ולכן זו חובה לשמור על הדגימות קריר להימנע מקציפים בכל עת. ג) caproBox מתקרר דגימות כדי 0-4 מעלות צלזיוס, המנורות פולטות אור UV, אך גם פולטים חום. לכן יש צורך בקצרה צנטריפוגות מבחנות לפני ההקרנה, ולכן חלבונים דבקות כמוסות או קירות הבקבוקון לא יכול להיווצר משקעים זרעים. ד) מחדש את ההשעיה של חרוזים מגנטיים (למשל הפתרונות לשטוף) לא ניתן יד, זמן קצר חלה אולטרסאונד על ידי הצבת דגימות לאמבטיה אולטרסאונד. ה) טרי להכין את הפתרון 0.2% ACN TFA/60%. מצאנו כי אחרת את החלבונים שנתפסו לא יכול להיות ביקע מן החרוזים. ו) בסופו של חלבונים שנתפסו מתבצעת על ידי LC-MS/MS. ספקטרומטריית מסה היא שיטה רגישה מאוד. זה הכרחי להשתמש ריאגנטים בלעדי LC-MS כיתה השלבים הסופיים (2.11 צעד ועוד). הימנע זיהום של ניסויים על ידי מקורות חלבון חיצוני, קרטין כגון אבק או שמקורם מן הנסיין. במיוחד במהלך השלבים העיכול הסופי, מומלץ לשים לב שטח עבודה נקי, ללבוש כפפות וחלוק מעבדה ואולי רשת שיער או באופן אידיאלי לבצע את השלבים הסופיים מתחת לספסל נקי. הכן את 50 mM אמוניום ביקרבונט המאגר משמש לעיכול tryptic במים MS LC כיתה, דרך מסנן 0.22 מיקרומטר, חנות לסנן, aliquot ב -20 ° C, ולהשתמש בכל aliquot רק פעם אחת, כדי למנוע זיהומים. הפתרון טריפסין (סידור כיתה, רוש, להכין 0.5 מיקרוגרם / פתרון μl ידי הוספת 1 mM HCl כדי lyophilized טריפסין) ניתן לאחסן 4 ° C למשך מספר שבועות. ז) כדי לקבל ספקטרום המוני אמין חיוני יש לרסס יציב בניתוח ESI-MS/MS. ח) עבור מערכות LC-MS/MS שונה מזו השתמשו במחקר הנוכחי, מדידת פרמטרים אלגוריתמים לזיהוי פפטידים חייב להיות מותאם באופן אינדיבידואלי. את השינויים הבאים הם אפשריים ביחס פרוטוקול המתואר:) לחילופין כדי לשחרר את החלבונים מן החרוזים ידי TFA 60% ACN/0.2% (שלב 2.11), חלבונים ניתן ישירות מתעכל tryptically בתוך ההשעיה חרוז (כרכים זהה בשלב 5.1) או, SDS-PAGE, חלבונים ניתן שפורסמו על ידי השעיית וחימום החרוזים שנאסף לאחר שלב 2.9-95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות במאגר מדגם SDS (שניהם, את ההשעיה כולו או רק את supernatant ניתן לטעון לכיס ג&#39;ל). מצאנו כי החרוזים לאט לשחרר כמויות קטנות של הפולימר לתוך בתמיסה מימית לעכל tryptic במהלך לעכל על חרוז tryptic גם לאחר מספר צעדים לשטוף מימית. זיהום פולימר מפריע זיהוי הפפטיד MS וניתן לשטוף את החרוזים באמצעות ACN 80% (לפחות שלוש פעמים). לאחר השלבים לשטוף 80% ACN, החרוזים יש לשטוף מיד עם מים לפני לעכל על חרוז tryptic. ב) כתמים המערבי באמצעות streptavidin-horseraddish peroxidase ואת המצע ECL יכול לשמש גם כדי להמחיש crosslinking מוצלח של CC ביוטין המכיל את החלבונים. לכן, גם הג&#39;ל המתקבל לאחר שלב 3.2 ניתן מחק או, כי הרגישות היא על פי 10 גבוה יותר מאשר צביעת כסף של ג&#39;לים, 10 דגימות μl אחרי צעד 2.7 עשוי גם להיות מנותח על ידי כתם המערבי. Mind כי במקרה האחרון חלבונים biotinylated endogeneously יהיה גם זוהה מלבד החלבונים biotinylated באופן מלאכותי על ידי אדון-CC. ג) מצאנו כי זה תלוי במערכת מיוחדת (lysate, התייחס חלבונים היעד, סלקטיביות ותפקוד תגובתיות של CC הוא), האם &quot;off-חרוז&quot; תצורה, שם את התגובה crosslinking מתרחש בין CC חופשית חלבון בתמיסה 4 או המתואר כיום &quot;על חרוז&quot; תצורה (איור 1B) מבצעת טוב יותר. באופן כללי, השיטה צריכה גם להיות תואם עם כל מדינה-of-the איזוטופ יציב אמנות החלבון או הפפטיד תיוג הטכנולוגיה, או הערכה של המדגם ללכוד על ידי ג&#39;ל אלקטרופורזה 2D. ב התצורה &quot;off-חרוז&quot;, אפשר גם ללכוד חלבונים בתוך תאים שלמים (תוצאות לא פורסם). יתר על כן, התרופה או אתר cofactor מחייב של חלבון יכול להיות שתוארו על ידי קביעת עמדה מקרוב על ידי crosslinking של CC בתוך רצף החלבון על ידי רצף הפפטיד MS. מצב המחייב של מולקולה קטנה לחלבון ניתן לחקור באמצעות ג שונהמצורף עמדות hemical על הפונקציה סלקטיביות, והמקשר באורכים שונים. כפי שמוצג במחקר הנוכחי, גם שותפים חלבון מחייב של חלבונים פנה ידי הפונקציה סלקטיביות (RplK כמו המצע של PrmA) או לא ידוע חלבון קטן מולקולה אינטראקציות (אדון על GlnA) ניתן לזהות. סיכם, תכונה נוספת של CCS, תגובתיות צילום crosslinking, מאפשר בידוד וזיהוי של חלבונים בשפע נמוך או משפחות חלבון פונקציונלי מתערובות חלבון מורכב עם רגישות גבוהה ומספקת למדענים כלי נוסף ללימוד מולקולה קטנה - אינטראקציות חלבון .

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>SAH caproKit&trade;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>caprotec bioanalytics GmbH</td>
<td>1-1010-050 (50 reactions) 1-1010-010 (10 reactions)</td>
<td>Includes the SAH-CC, SAH competitor, streptavidin coated magnetic beads, capture buffer, and wash buffer</td>
</tr>
<tr>
<td>caproBox&trade;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>caprotec bioanalytics GmbH</td>
<td>1-5010-003 (110 V) 1-5010-004 (230 V)</td>
<td>For reproducible photo-activation while cooling the samples</td>
</tr>
<tr>
<td>caproMag&trade;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>caprotec bioanalytics GmbH</td>
<td>1-5100-001</td>
<td>For easy handling of magnetic particles without pipetting</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

profiling of methyltransferases and other s-adenosyl-l-homocysteine-binding proteins by capture compound mass spectrometry (ccms)

יש מגוון של גישות כדי להפחית את המורכבות של proteome על בסיס פונקציונלי של מולקולות חלבון אינטראקציות קטנות כגון זיקה כרומטוגרפיה 1 או חלבון על בסיס פעילות פרופיל 2. תרכובות לכידת Trifunctional (CCS, איור 1 א) 3 הם בסיס לגישה גנרי, שבו שיווי המשקל הראשונית מונחה אינטראקציה בין בדיקה מולקולה קטנה (הפונקציה סלקטיביות, כאן S-adenosyl-L-הומוציסטאין, אדון, איור 1 א) חלבונים היעד הוא קבוע ובלתי הפיך על crosslinking-photo בין פונקציית צילום activable עצמאית תגובתיות (כאן phenylazide) של CC לבין פני השטח של חלבונים היעד. הפונקציה מיון (כאן ביוטין) משמש כדי לבודד את CC - conjugates חלבון מתערובות ביולוגיות מורכבות בעזרת בשלב מוצק (כאן חרוזים streptavidin מגנטי). שתי תצורות הניסויים הם אפשריים: &quot;מחוץ חרוז&quot; 4 או המתואר כיום &quot;על חרוז&quot; תצורה (איור 1B). הפונקציה הסלקטיביות עשויה להיות כמעט כל מולקולה קטנה של עניין (מצעים, מעכבי, מולקולות התרופה). S-Adenosyl-L-מתיונין (SAM, איור 1 א) היא ככל הנראה, שני ATP, cofactor הנפוץ ביותר בטבע 5, 6. הוא משמש בתור התורם העיקרי קבוצת מתיל בכל היצורים החיים עם התגובה הכימית להיות catalyzed ידי SAM תלויי methyltransferases (MTases), אשר methylate 7-DNA, RNA 8, 9 חלבונים או מולקולות קטנות 10. לאור תפקיד מכריע של תגובות פיזיולוגיות מתילציה בתרחישים שונים (ויסות הגנים, אפיגנטיקה, מטבוליזם), פרופילים של MTases ניתן לצפות להיות חשיבות דומה proteomics פונקציונלי כמו פרופיל של קינאזות. כלים אנליטיים עבור פרופילים שלהם, לעומת זאת, לא היה זמין. אנו הציגה לאחרונה CC עם אדון כקבוצה סלקטיביות למלא את הפער הטכנולוגי (איור 1A). אדון, תוצר של SAM לאחר העברת מתיל, הוא מעכב ידוע בכלל MTase המוצר 11. מסיבה זו וגם בגלל הטבעית cofactor SAM נמצא בשימוש על ידי אנזימים נוסף העברת חלקים אחרים של cofactor או ליזום התגובות הרדיקלי, כמו גם בגלל חוסר היציבות הכימית שלה 12, אדון הוא פונקציה סלקטיביות אידיאלי CC למקד MTases. כאן אנו מדווחים על השירות של אדון-CC ו CCMS ידי MTases פרופילים אחרים אדון מחייב חלבונים מן DH5α את המתח של Escherichia coli (E. coli), אחד הטובים ביותר, מאופיין פרוקריוטים, אשר שימש המודל המועדף האורגניזם מחקרים ביוכימיים, ביולוגיים ביוטכנולוגיים אינספור. תמונה המופעל crosslinking משפר את התשואה ואת הרגישות של הניסוי, ואת הספציפיות ניתן לבדוק בקלות עבור בניסויים התחרות באמצעות עודף של אדון חינם.

Watch this Scientific Journal Video about Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry CCMS at JoVE.com

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry CCMS

תרכובות לכידת הם מולקולות קטנות trifunctional כדי להפחית את המורכבות של proteome על ידי תפקודית אינטראקציה הפיך מולקולות חלבון קטן ואחריו crosslinking-צילום טיהור. כאן אנו משתמשים מתחם לכידת עם<em&gt; S</em&gt;-Adenosyl-<sub&gt; L</sub&gt;-הומוציסטאין מחייב כפונקציה סלקטיביות לבודד methyltransferases מ<em&gt; Escherichia coli</em&gt; התא כולו lysate לזהות אותם על ידי MS.

פרופיל של Methyltransferases ועל אחרים S-Adenosyl- L-הומוציסטאין מחייב חלבונים על ידי ספקטרומטריית מתחם המיסה לכידה (CCMS)

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity ...

Research

JoVE Journal

Biology

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS)

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

MALDI הכנה לדוגמא: שיטת אולטרה שכבה דקה

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Antibody Profiling by Luciferase Immunoprecipitation Systems (LIPS)

Antibody Profiling by Luciferase Immunoprecipitation Systems LIPS

נוגדן פרופיל על ידי מערכות immunoprecipitation בלוציפראז (שפתיים)

Technologies for comprehensively understanding and quantifying antibody profiles to autoantigens and infectious agents may yield new insights into disease ...

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

ניתוח מערכות חלבון גדול על ידי ספקטרומטריית מסה מבנית

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

OLIgo Mass Profiling (OLIMP) of Extracellular Polysaccharides

OLIgo Mass Profiling OLIMP of Extracellular Polysaccharides

אוליגו פרופיל המוניים (OLIMP) של סוכרים תאית

The direct contact of cells to the environment is mediated in many organisms by an extracellular matrix. One common aspect of extracellular matrices is ...

Atmospheric-pressure Molecular Imaging of Biological Tissues and Biofilms by LAESI Mass Spectrometry

בלחץ אטמוספרי מולקולרית והדמיה של רקמות ביולוגיות באמצעות Biofilms LAESI המוניים ספקטרומטריית

Ambient ionization methods in mass spectrometry allow analytical investigations to be performed directly on a tissue or biofilm under native-like ...

Direct Analysis of Single Cells by Mass Spectrometry at Atmospheric Pressure

ניתוח ישיר של תאים בודדים באמצעות ספקטרומטריית מסה בלחץ אטמוספרי

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

כימות של חלבונים באמצעות העשרה Immunoaffinity פפטיד יחד עם ספקטרומטריית מסה

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry

פרופיל Proteome חיזור תיאול באמצעות תיוג איזוטופ ספקטרומטריית מסה

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on ...

Capture Compound Mass Spectrometry - A Powerful Tool to Identify Novel c-di-GMP Effector Proteins

ספקטרומטריית מתחם מיסת לכידה - כלי רב עוצמה לזיהוי הרומן ג-di-GMP חלבונים מפעיל

Considerable progress has been made during the last decade towards the identification and characterization of enzymes involved in the synthesis ...

Sequence-specific Labeling of Nucleic Acids and Proteins with Methyltransferases and Cofactor Analogues

תיוג רצף ספציפי של חומצות גרעין וחלבונים עם Methyltransferases ואנלוגים כקו-פקטורים

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific ...