Name: profiling of methyltransferases and other s-adenosyl-l-homocysteine-binding proteins by capture compound mass spectrometry (ccms)
Uploaded: 2010-12-20T16:20:00
Duration: 17 min 12 s
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Questo lavoro è stato sostenuto dal umane Frontier Science Program Organization (HFSP Award 2007, RGP0058/2007-C). Ringraziamo il Prof. Richard Roberts per l&#39;avvio del progetto e per le discussioni fruttuose.

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I., Keller, A., Kolker, E., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+statistical+model+for+identifying+proteins+by+tandem+mass+spectrometry.">A statistical model for identifying proteins by tandem mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 75, 4646-4658 (2003).</li></ol>

ThomasLenz, OliviaGrabner, MirkoGlinski, MathiasDreger e HubertKosterare impiegati da caprotec bioanalytics GmbH, Inc che produce alcuni dei reagenti utilizzati in questo articolo.

Le seguenti precauzioni e osservazioni possono essere utili quando si segue il protocollo descritto: a) Uno dei principali vantaggi di CC sta nella formazione di un legame covalente tra la CC e la MTase, in quanto ciò permette di successive condizioni di lavaggio stringenti. Il covalente reticolazione è ottenuta mediante un fotoreazione innescata dalla luce UV (310 nm max.). Plafoniera normale contiene solo una piccola frazione di raggi UV, invece, proteggere la SAH-CC da lunga esposizione alla luce anche in testa o sole fino al irraggiamento controllato e raffreddato in caproBox. b) I campioni biologici da cui il MTases devono essere isolati possono contenere proteine ​​incline alla denaturazione, di conseguenza è obbligatorio mantenere i campioni freschi ed evitare la formazione di schiuma in ogni momento. c) Il caproBox raffredda i campioni a 0-4 ° C, le lampade che emettono la luce UV, tuttavia, anche emettono calore. Pertanto è necessario centrifugare brevemente le provette prima di irradiazione, così le proteine ​​che aderiscono al tappi o pareti flaconcino non possono formare semi di precipitazione. d) Se risospensione delle sfere magnetiche (ad esempio nelle soluzioni di lavaggio) non è possibile a mano, a breve si applicano gli ultrasuoni, ponendo i campioni in un bagno a ultrasuoni. e) fresco preparare la soluzione allo 0,2% ACN TFA/60%. Abbiamo scoperto che in caso contrario le proteine ​​catturate non può essere aperto dal perline. f) L&#39;analisi finale delle proteine ​​catturate è svolta da LC-MS/MS. Spettrometria di massa è un metodo altamente sensibile. E &#39;necessario utilizzare i reagenti esclusivamente LC-MS grado nelle fasi finali (punto 2.11 e oltre). Evitare la contaminazione degli esperimenti da fonti di proteine ​​esterne, ad esempio, cheratina proveniente dalla polvere o dal sperimentatore. Soprattutto durante le fasi di digestione finale, si raccomanda di prestare attenzione a uno spazio di lavoro pulito, di indossare guanti ed un camice da laboratorio e, eventualmente, una rete di capelli o idealmente eseguire le fasi finali sotto una panchina pulita. Preparare il tampone di ammonio 50 mM di bicarbonato usato per digerire il trittico in acqua LC MS grado, filtrare attraverso filtro 0,22 micron, aliquota, conservare a -20 ° C, e usare ogni aliquota una sola volta per evitare contaminazioni. La soluzione di tripsina (sequenziamento grado, Roche, preparare un 0,5 ug / ul di soluzione con l&#39;aggiunta di 1 mM HCl al liofilizzato tripsina) può essere conservato a 4 ° C per diverse settimane. g) Per ottenere spettri di massa affidabile è essenziale per avere un getto stabile in analisi ESI-MS/MS. h) Per gli altri sistemi LC-MS/MS rispetto a quello utilizzato nel presente studio, i parametri di misura e gli algoritmi di identificazione del peptide deve essere adattato individualmente. Le seguenti modifiche sono possibili riguardo al protocollo descritto: a) In alternativa al rilascio delle proteine ​​da perle di TFA 60% ACN/0.2% (punto 2.11), le proteine ​​possono essere direttamente tryptically digerito all&#39;interno di una sospensione tallone (stessi volumi al punto 5.1) o, per SDS-PAGE, le proteine ​​possono essere rilasciati sospendendo il riscaldamento e le perle raccolte dopo passo 2,9-95 ° C per 10 min in tampone campione SDS (entrambi, la sospensione o solo il supernatante può essere caricato nella tasca di gel). Abbiamo scoperto che le perle rilasciare lentamente piccole quantità di polimeri in soluzione acquosa trittico digerire durante il trittico-tallone digerire anche dopo molti lavaggi acquosi. La contaminazione polimero interferisce con l&#39;identificazione MS peptide e può essere lavato via le perline con ACN 80% (almeno tre volte). Dopo i passi ACN 80% di lavaggio, le perline devono essere lavato con acqua prima sul tallone digerire trittico. b) Western blot utilizzando streptavidina-perossidasi horseraddish e substrato ECL può essere utilizzato anche per visualizzare reticolazione successo del CC che contiene biotina alle proteine. Allora, o il gel ottenuto dopo la fase 3.2 possono essere cancellati o, perché la sensibilità è circa 10 volte superiore a quella colorazione argento di gel, 10 campioni di 2,7 microlitri dopo passo può essere analizzata anche da western blot. Ricordate che in quest&#39;ultimo caso le proteine ​​endogeneously biotinilato sarà anche rilevato oltre le proteine ​​artificialmente biotinilato dal SAH-CC. c) Abbiamo scoperto che dipende dal particolare sistema (lisato, indirizzata proteine ​​bersaglio, la selettività e la funzione della reattività di lui CC), se la configurazione &quot;off-perla&quot;, dove la reazione di reticolazione avviene tra CC liberi e proteine ​​in soluzione 4 o le persone che sono descritti di configurazione &quot;a-perla&quot; (Figura 1B) funziona meglio. In generale, il metodo deve essere compatibile con qualsiasi state-of-the proteina isotopo stabile l&#39;arte o la tecnologia di etichettatura peptide, o la valutazione del campione di cattura da parte elettroforesi su gel 2D. Nella configurazione &quot;off-perla&quot;, è anche possibile catturare le proteine ​​all&#39;interno delle cellule intere (risultati non pubblicati). Inoltre, il farmaco o sito cofattore legame di una proteina può essere delineato determinando il primo da posizione reticolazione del CC all&#39;interno della sequenza della proteina mediante sequenziamento MS peptide. La modalità di legame di una piccola molecola ad una proteina può essere esplorata utilizzando diversi cposizioni di fissaggio chimici ed alla funzione di selettività e di diverse lunghezze linker. Come mostrato nel presente studio, anche partner legame proteico delle proteine ​​indirizzata dalla funzione di selettività (RplK come substrato di PRMA) o sconosciuto piccola proteina molecola (SAH a GlnA) può essere identificato. Sintesi, la caratteristica aggiuntiva del CC, la foto-reticolazione reattività, consente l&#39;isolamento e l&#39;identificazione di proteine ​​a basso abbondanti o famiglie di proteine ​​funzionali da miscele complesse di proteine ​​ad alta sensibilità e fornisce agli scienziati un ulteriore strumento per lo studio di piccole molecole - interazioni proteina .

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		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
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<tr>
<td>SAH caproKit&trade;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>caprotec bioanalytics GmbH</td>
<td>1-1010-050 (50 reactions) 1-1010-010 (10 reactions)</td>
<td>Includes the SAH-CC, SAH competitor, streptavidin coated magnetic beads, capture buffer, and wash buffer</td>
</tr>
<tr>
<td>caproBox&trade;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>caprotec bioanalytics GmbH</td>
<td>1-5010-003 (110 V) 1-5010-004 (230 V)</td>
<td>For reproducible photo-activation while cooling the samples</td>
</tr>
<tr>
<td>caproMag&trade;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>caprotec bioanalytics GmbH</td>
<td>1-5100-001</td>
<td>For easy handling of magnetic particles without pipetting</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

profiling of methyltransferases and other s-adenosyl-l-homocysteine-binding proteins by capture compound mass spectrometry (ccms)

C&#39;è una varietà di approcci per ridurre la complessità del proteoma sulla base di piccole molecole funzionali-proteina interazioni come cromatografia di affinità 1 o Activity Based Protein Profiling 2. Composti Capture trifunzionale (CC, Figura 1A) 3 sono la base per un approccio generico, in cui l&#39;iniziale equilibrio basato sull&#39;interazione tra una sonda piccola molecola (la funzione di selettività, qui S-adenosil-L-omocisteina, SAH, Figura 1A) e proteine ​​bersaglio è irreversibilmente fissi su foto-reticolazione tra un foto-indipendente attivabile funzione reattività (ecco un phenylazide) del CC e la superficie delle proteine ​​bersaglio. La funzione di ordinamento (qui biotina) serve per isolare il CC - coniugati proteine ​​complesse miscele biologiche con l&#39;aiuto di una fase solida (qui perline streptavidina magnetica). Due configurazioni degli esperimenti sono possibili: &quot;off-perla&quot; 4 o le persone che sono descritti di configurazione &quot;a-perla&quot; (Figura 1B). La funzione di selettività può essere virtualmente qualsiasi piccole molecole di interesse (substrati, inibitori, molecole di farmaco). S-adenosil-L-metionina (SAM, Figura 1A) è probabilmente, secondo ATP, il cofattore più usato in natura 5, 6. Viene utilizzato come il principale donatore del gruppo metile in tutti gli organismi viventi con la reazione chimica viene catalizzata da SAM-dipendente metiltransferasi (MTases), che il DNA metilato di 7, 8 RNA, proteine ​​9, o piccole molecole 10. Considerato il ruolo fondamentale delle reazioni di metilazione nelle diverse situazioni fisiologiche (regolazione genica, l&#39;epigenetica, metabolismo), la profilazione dei MTases si può aspettare di diventare di importanza simile in proteomica funzionale come la profilazione delle chinasi. Strumenti analitici per il loro profilo, tuttavia, non sono stati disponibili. Abbiamo recentemente introdotto un CC con emorragia subaracnoidea, come gruppo di selettività di colmare questa lacuna tecnologica (Figura 1A). SAH, il prodotto di SAM dopo il trasferimento di metile, è un noto inibitore generale del prodotto MTase 11. Per questo motivo e per la naturale cofattore SAM viene utilizzato da enzimi ulteriormente il trasferimento in altre parti del cofattore o innescando reazioni radicali come pure a causa della sua instabilità chimica 12, SAH è una funzione di selettività ideale per un CC a bersaglio MTases. Qui riportiamo l&#39;utilità del SAH-CC e CCMS da MTases profiling e altri SAH-binding proteins dal DH5α ceppo di Escherichia coli (E. coli), uno dei più caratterizzato i procarioti, che ha servito come modello preferito organismo in innumerevoli studi biochimici, biologici e biotecnologici. Fotoattivate reticolazione migliora la resa e la sensibilità dell&#39;esperimento, e la specificità può essere facilmente verificato in esperimenti di competizione con un eccesso di libero SAH.

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Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry CCMS

Composti cattura sono trifunzionale piccole molecole per ridurre la complessità del proteoma funzionale reversibile da piccola molecola-proteina seguiti da foto-reticolazione e purificazione. Qui si usa un composto di cattura con<em&gt; S</em&gt;-Adenosil-<sub&gt; L</sub&gt;-Omocisteina vincolante in quanto la funzione di isolare la selettività metiltransferasi da un<em&gt; Escherichia coli</emCellulari&gt; intero lisato e identificarli da MS.

Profilatura di metiltransferasi e altri S-Adenosil- L-Omocisteina-binding proteine ​​mediante spettrometria di massa Compound Capture (CCMS)

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