Name: profiling of methyltransferases and other s-adenosyl-l-homocysteine-binding proteins by capture compound mass spectrometry (ccms)
Uploaded: 2010-12-20T16:20:00
Duration: 17 min 12 s
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この作品は、ヒューマンフロンティアサイエンスプログラム推進機構（HFSPアワード2007、RGP0058/2007-C）によってサポートされていました。我々はプロジェクトを開始するためと有意義な議論のための教授リチャードロバーツに感謝。

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ThomasLenz、OliviaGrabner、MirkoGlinski、MathiasDreger、そしてこの記事で使用する試薬の一部を生成するcaprotec bioanalytics社、株式会社に雇用さHubertKosterare。

記述されたプロトコルを以下のときは、次の注意事項とコメントは役に立つかもしれません：これは、その後の厳しい洗浄条件を許可するようにCCの）主要な利点は、CCとMTase間の共有結合の形成にある。共有結合架橋は、UV光（310 nmの最大）によって引き起こされる光反応によって達成される。通常のオーバーヘッドの光は紫外線のごく一部が含まれている、しかし、上caproBoxの制御と冷却照射のオーバーヘッド、あるいは太陽の光に長く曝露によるSAH - CCを保護する。 B）MTasesが分離される元となる生体試料が変性を起こしやすいタンパク質を含む可能性がある、従ってそれは、試料を低温に保つため、常に泡を避けるために必須です。 C）caproBoxが0〜4にサンプルを冷却° C、UV光を発するランプは、しかし、また熱を発する。したがって、それは一時的に照射する前にバイアルを遠心分離する必要があるので、キャップやバイアルの壁に付着したタンパク質は、降水量の種子を形成することはできません。 D）磁性ビーズの再懸濁が（洗浄溶液などにおいて）手で不可能な場合は、すぐに超音波浴中に試料を配置することにより、超音波を適用する。 e）の新鮮な0.2パーセントTFA/60％のACN溶液を調製。我々は、そうでなければ捕捉されたタンパク質がビーズから切断されていない可能性がありますことを発見。 f）に捕捉されたタンパク質の最終的な分析は、LC-MS/MSにより実施される。質量分析法は高​​感度な方法です。それは最後のステップ（ステップ2.11とさらに）で排他的にLC - MSグレード試薬を使用する必要があります。外部のタンパク質源、ほこりからまたは実験者からの発信などのケラチンでの実験のコンタミネーションを避ける。特に最終的な消化のステップの間に、それは、清潔な作業スペースに注意を払うために手袋を着用すると白衣と多分ヘアネットまたは理想的にはクリーンベンチの下に最終的な手順を実行することをお勧めします。フィルタ、分注し、-20℃で保存し、汚染を避けるために一度だけ各アリコートを使用して0.22μmのフィルター、LC MSグレードの水の中でトリプシン消化物に使用する50mMの重炭酸アンモニウムバッファを準備します。トリプシン溶液（クエンシンググレード、ロシュ、凍結乾燥したトリプシンに1mMのHClを添加、0.5μg/μLの溶液を調製）を、4℃で数週間保存することができます。 g）を信頼性の高いマススペクトルを得るためには、ESI-MS/MS分析で安定したスプレーを持つことが不可欠です。 H）本研究で使用したもの以外のLC-MS/MSシステムでは、測定パラメータとペプチド同定アルゴリズムを個別に調整する必要があります。 次の変更を説明するプロトコルに関して可能です：60％ACN/0.2％TFA（ステップ2.11）でビーズからタンパク質を放出する代わりに）、タンパク質は直接trypticallyビーズ懸濁液（同じボリュームなどの内で消化することができます。ステップ5.1）でまたは、SDS - PAGEのために、タンパク質を95ステップ2.9の後に収集されたビーズを懸濁し、加熱することによって解除することができます℃のSDSサンプルバッファーで10分（両方とも、全体の停止または上清のみをロードすることができるためゲルのポケットに）。我々は、ビーズがゆっくりであっても、いくつかの水系洗浄ステップの後で、ビーズトリプシン消化物中に水性のトリプシン消化物の溶液中にポリマーの少量を解放することを発見。ポリマーの汚染は、MSペプチドの同定と干渉し、80％ACNを（少なくとも3回）を使用してビーズから洗浄することができます。 80％ACNの洗浄ステップの後、ビーズを前に、オンビーズトリプシン消化物に水で1回洗浄してください。 B）ストレプトアビジン- horseraddishペルオキシダーゼおよびECL基質を用いたウェスタンブロットはまた、タンパク質にビオチンを含むCCの成功架橋を可視化するために使用することができます。したがって、ステップ3.2の後に得られるいずれのゲルをブロットすることができるまたは、感度が10倍程度であるため、ステップ2.7の後に10μlのサンプルを、ゲルの銀染色よりも高いにもウェスタンブロットで分析することができます。後者の場合にendogeneouslyビオチン化タンパク質はまた、人為的にSAH - CCによるビオチン化タンパク質のほかに検出されることに留意。 c）我々は、架橋反応が溶液4で自由CCとタンパク質の間で行われる&quot;オフビード&quot;の構成、どうか、（ライセート、標的タンパク質、選択性と彼CCの反応性の機能を対処）それは特殊なシステムに依存することを見出したまたは現在説明&quot;上のビーズ&quot;の構成（図1B）は、パフォーマンスが向上します。 一般的には、この方法はまた、あらゆる最先端の安定同位体の蛋白質またはペプチドの標識技術、または2次元ゲル電気泳動によるキャプチャのサンプルの評価と互換性があります。 &quot;オフ - ビーズ&quot;構成では、全細胞（未発表結果）内のタンパク質をキャプチャすることも可能です。さらに、薬剤またはタンパク質の補因子結合部位は、MSペプチド配列決定によりタンパク質配列内にCCのすぐ近くの架橋の位置を決定することにより説明することができます。蛋白質への小分子の結合様式は異なるC言語を使用して調べることができます選択性の機能と異なるリンカー長でhemical取り付け位置。として選択する機能によってアドレスのタンパク質のタンパク質結合パートナー（PRMAの基質としてRplK）また、本研究で示されているか、または未知の小分子のタンパク質の相互作用（GlnAにSAH）を識別することができます。要約、CCの追加機能、光架橋反応は、高感度で、複雑なタンパク質混合物から低濃度タンパク質や機能性タンパク質のファミリーの分離と同定を可能にし、低分子化合物を研究するための追加のツールを科学者を提供 - タンパク質相互作用。

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>SAH caproKit&trade;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>caprotec bioanalytics GmbH</td>
<td>1-1010-050 (50 reactions) 1-1010-010 (10 reactions)</td>
<td>Includes the SAH-CC, SAH competitor, streptavidin coated magnetic beads, capture buffer, and wash buffer</td>
</tr>
<tr>
<td>caproBox&trade;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>caprotec bioanalytics GmbH</td>
<td>1-5010-003 (110 V) 1-5010-004 (230 V)</td>
<td>For reproducible photo-activation while cooling the samples</td>
</tr>
<tr>
<td>caproMag&trade;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>caprotec bioanalytics GmbH</td>
<td>1-5100-001</td>
<td>For easy handling of magnetic particles without pipetting</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

profiling of methyltransferases and other s-adenosyl-l-homocysteine-binding proteins by capture compound mass spectrometry (ccms)

アフィニティークロマトグラフィーなど1または活動ベースのタンパク質プロファイリング2のような機能性小分子とタンパク質の相互作用に基づいてプロテオームの複雑さを軽減するためのさまざまなアプローチがあります。三官能キャプチャ化合物（CCS、図1A）3は 、一般的なアプローチの基礎とされている初期の平衡駆動型の低分子プローブ（ここで選択性の機能、S -アデノシル- L -ホモシステイン、SAH、図1A）との間の相互作用と標的タンパク質は、不可逆的にCCの独立した光活性化反応の機能（ここでphenylazide）と標的蛋白質の表面との間の光架橋により固定されています。固相（ここでストレプトアビジン磁気ビーズ）の助けを借りて、複雑な生物学的な混合物からタンパク質複合体 - ソート関数（ここでビオチン）は、CCを分離するのに役立つ。実験の二つの構成が可能です：&quot;オフビーズ&quot;4または現在説明&quot;上のビーズ&quot;の構成（図1B）。選択性の機能は、関心のあるほぼすべての小分子（基質、阻害剤、薬物分子）があります。 （SAM、図1A）S -アデノシル- L -メチオニンは、おそらくATP、自然5、6で最も広く使用されている因子に2番目です。それはDNA 7メチル化SAM依存メチルトランスフェラーゼ（MTases）、、RNA 8、蛋白質9、または小分子10で触媒される化学反応を持つすべての生物の主要なメチル基供与体として使用されます。多様な生理学的なシナリオでのメチル化反応の重要な役割（遺伝子制御、エピジェネティクス、代謝）を考えると、MTasesのプロファイリングは、キナーゼのプロファイリングなど、機能的プロテオミクスにおける同様の重要性になることを期待することができます。彼らのプロファイリングのための分析ツールは、しかし、利用されていない。我々は最近、この技術格差（図1A）を埋めるために選択性のグループとしてSAHとCCを導入しました。 SAH、メチル転移後のSAMの製品は、既知の一般的なMTase製品の阻害剤11です。このような理由から、天然補酵素SAMが原因で、その化学的不安定性の12因子の他の部分を転送するかだけでなく、ラジカル反応を開始、さらに酵素で使用されているため、SAHは、ターゲットMTasesへのCCの理想的な選択性の関数です。ここで、我々は、 大腸菌の株DH5α（ 大腸菌 ）からMTasesと他のSAH結合タンパク質をプロファイリングすることによって好ましいモデルを務めている最高の特徴と原核生物、のいずれかをSAH - CCとCCMSのユーティリティを報告する数え切れないほどの、生化学、生物学、およびバイオテクノロジーの研究で生物。写真活性化架橋は、実験の収量と感度を向上させ、特異性は容易に自由SAHの過剰を使用して競合実験のためにテストすることができます。

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Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry CCMS

キャプチャ化合物は、光架橋および精製に続いて​​機能的な可逆小分子 - タンパク質相互作用により、プロテオームの複雑さを軽減するために三官能性低分子化合物です。ここでは、使用してキャプチャーコンパウンドを使用<em&gt; S</em&gt; -アデノシル-<sub&gt; L</sub&gt; -ホモシステイン結合選択性の関数としてのメチルトランスフェラーゼを分離する<em&gt;大腸菌</em&gt;全細胞は、溶解液とMSでそれらを識別する。

メチルトランスフェラーゼのプロファイリングおよびその他の S -アデノシル- L</subキャプチャの複合質量分析法（CCMS）別> -ホモシステイン結合タンパク質

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