Name: profiling of methyltransferases and other s-adenosyl-l-homocysteine-binding proteins by capture compound mass spectrometry (ccms)
Uploaded: 2010-12-20T16:20:00
Duration: 17 min 12 s
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Este trabalho foi financiado pelo Human Frontier Organization Programa Ciência (HFSP Award 2007, RGP0058/2007-C). Agradecemos ao Prof Richard Roberts para o início do projeto e para discussões frutíferas.

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ThomasLenz, OliviaGrabner, MirkoGlinski, MathiasDreger e HubertKosterare empregados por caprotec Bioanalítica GmbH, Inc, que produz alguns dos reagentes utilizados neste artigo.

As seguintes precauções e comentários podem ser úteis quando, seguindo o protocolo descrito: a) A vantagem principal de CCs reside na formação de uma ligação covalente entre o CC eo MTase, pois isso permite subseqüentes condições de lavagem rigorosa. A reticulação covalente é realizado por um fotorreação desencadeada pela luz UV (310 nm max.). Luz do teto normal contém apenas uma pequena fração dos raios UV, no entanto, proteger a HAS CC-de maior tempo de exposição à sobrecarga ou mesmo a luz sol a irradiação controlada e de refrigeração na caproBox. b) As amostras biológicas de que o MTases devem ser isolados podem conter proteínas propensas a desnaturação, conseqüentemente, é obrigatório manter as amostras legal e para evitar a formação de espuma em todos os momentos. c) O caproBox esfria as amostras para 0-4 ° C, as lâmpadas que emitem a luz UV, no entanto, também emitem calor. Portanto, é necessário fazer uma breve centrifugação os frascos antes da irradiação, de modo proteínas aderindo à tampas de frasco ou paredes não pode formar sementes precipitação. d) Se re-suspensão das esferas magnéticas (por exemplo, as soluções de lavagem) não é possível com a mão, logo aplicar ultra-som, colocando as amostras em banho de ultra-som. e) Freshly preparar a solução ACN 0,2% TFA/60%. Descobrimos que de outra forma as proteínas capturados não pode ser clivada dos grânulos. f) A análise final das proteínas capturado é realizado por LC-MS/MS. Espectrometria de massa é um método altamente sensível. É necessário o uso de reagentes exclusivamente LC-MS grau nas etapas finais (passo 2.11 e mais). Evitar a contaminação dos experimentos por fontes de proteína externa, por exemplo, a queratina provenientes de poeira ou do experimentador. Particularmente durante as etapas finais da digestão, recomenda-se a prestar atenção a um espaço de trabalho limpo, usar luvas e um casaco de laboratório e, possivelmente, uma rede de cabelo ou, idealmente, realizar as etapas finais em uma bancada limpa. Prepare a 50 mM tampão bicarbonato de amônio usado para digerir tríptica em água LC MS grau, filtrar através de 0,22 mM, armazenar alíquota de filtro, a -20 ° C, e usar apenas uma vez cada alíquota para evitar contaminações. A solução de tripsina (seqüenciamento grau, Roche, preparar um 0,5 mg / mL solução pela adição de 1 mM HCl para liofilizado tripsina) pode ser armazenado a 4 ° C por várias semanas. g) Para obter espectros de massa de confiança é essencial para ter um spray estável em análise ESI-MS/MS. h) Para outros sistemas LC-MS/MS do que o utilizado no presente estudo, parâmetros de medição e algoritmos de identificação de peptídeos devem ser ajustadas individualmente. As seguintes modificações são possíveis com relação ao protocolo descrito: a) Como alternativa para liberar as proteínas dos grânulos em 60% TFA ACN/0.2% (passo 2.11), as proteínas podem ser diretamente tryptically digerida dentro de uma suspensão de esferas (volumes mesma no passo 5.1) ou, por SDS-PAGE, as proteínas podem ser liberados, suspendendo as contas de aquecimento e coletadas após a etapa 2,9-95 ° C por 10 min em tampão de amostra SDS (ambos, toda a suspensão ou apenas o sobrenadante pode ser carregado no bolso gel). Descobrimos que os grânulos liberam lentamente pequenas quantidades de polímeros em solução aquosa digerir tríptica durante on-bead digerir tríptica mesmo após várias etapas de lavagem aquosa. A contaminação interfere com polímero MS identificação de peptídeos e pode ser lavado as contas com 80% ACN (pelo menos três vezes). Após as etapas de lavagem de 80% ACN, as contas devem ser lavadas uma vez com água antes de on-bead digerir tríptica. b) Western blots utilizando estreptavidina-peroxidase e substrato horseraddish ECL também pode ser usado para visualizar crosslinking bem-sucedida do CC contendo biotina às proteínas. Portanto, ou o gel obtido após a etapa 3.2 pode ser apagado ou, porque a sensibilidade é cerca de 10 vezes maior do que a coloração de prata de géis, 10 amostras mL após a etapa 2,7 também podem ser analisados ​​por western blot. Lembre-se que neste último caso proteínas endogeneously biotinilado também será detectada além de proteínas artificialmente biotinilado pela HAS-CC. c) Descobrimos que depende do sistema especial (lisado, dirigida proteínas-alvo, seletividade e reatividade da função que ele CC), se o &quot;off-talão&quot; configuração, onde a reação de reticulação ocorre entre CC livre e proteínas em solução 4 ou o momento descrito &quot;on-talão&quot; configuração (Figura 1B) tem melhor desempenho. Em geral, o método também deve ser compatível com qualquer estado-da-arte da proteína isótopo estável ou tecnologia rotulagem peptídeo, ou avaliação da amostra captura por eletroforese em gel 2D. No &quot;off-talão&quot; de configuração, também é possível capturar proteínas dentro das células inteiras (dados não publicados). Além disso, a droga ou site cofactor ligação de uma proteína pode ser delineado por determinar a posição de reticulação bem perto do CC dentro da seqüência de proteínas por MS seqüenciamento de peptídeos. O modo de ligação de uma pequena molécula de uma proteína pode ser explorado usando diferentes chemical posições de anexação na função de seletividade e comprimentos diferentes linker. Como mostrado no presente estudo, os parceiros também proteína de ligação das proteínas dirigida pela função de seletividade (RplK como substrato de PRMA) ou desconhecidas interações pequena molécula de proteína (HAS para GINA) podem ser identificados. Resumida, a característica adicional do CCs, a reatividade foto crosslinking, permite o isolamento e identificação de proteínas de baixo abundante ou famílias de proteínas funcionais a partir de misturas complexas de proteínas com alta sensibilidade e fornece aos cientistas uma ferramenta adicional para o estudo de moléculas pequenas - interações proteína .

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		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
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		<tbody>
		
<tr>
<td>SAH caproKit&trade;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>caprotec bioanalytics GmbH</td>
<td>1-1010-050 (50 reactions) 1-1010-010 (10 reactions)</td>
<td>Includes the SAH-CC, SAH competitor, streptavidin coated magnetic beads, capture buffer, and wash buffer</td>
</tr>
<tr>
<td>caproBox&trade;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>caprotec bioanalytics GmbH</td>
<td>1-5010-003 (110 V) 1-5010-004 (230 V)</td>
<td>For reproducible photo-activation while cooling the samples</td>
</tr>
<tr>
<td>caproMag&trade;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>caprotec bioanalytics GmbH</td>
<td>1-5100-001</td>
<td>For easy handling of magnetic particles without pipetting</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

profiling of methyltransferases and other s-adenosyl-l-homocysteine-binding proteins by capture compound mass spectrometry (ccms)

Há uma variedade de abordagens para reduzir a complexidade do proteoma com base na pequena molécula de proteína funcional de interações tais como cromatografia de afinidade ou de um perfil a atividade da proteína Baseado 2. Compostos de Captura trifuncional (CCs, Figura 1A) 3 são a base para uma abordagem genérica, em que o equilíbrio inicial-driven interação entre uma sonda pequena molécula (a função de seletividade, aqui S-adenosil-L-homocisteína, HAS, Figura 1A) e proteínas-alvo é irreversível fixos foto crosslinking entre uma função de reatividade independente foto-que podem ser activados (aqui um phenylazide) do CC e da superfície das proteínas-alvo. A função de triagem (aqui biotina) serve para isolar o CC - conjugados de proteínas do complexo misturas biológica com a ajuda de uma fase sólida (grânulos aqui estreptavidina magnética). Duas configurações dos experimentos são possíveis: &quot;off-talão&quot; 4 ou o momento descrito &quot;on-talão&quot; configuração (Figura 1B). A função de seletividade pode ser praticamente qualquer molécula pequena de interesse (substratos, inibidores, moléculas da droga). S-adenosil-L-metionina (SAM, Figura 1A) é, provavelmente, segundo a ATP, o co-fator mais utilizado na natureza 5, 6. É usado como o principal doador de metila grupo em todos os organismos vivos com a reação química pode ser catalisada pela SAM-dependente metiltransferases (MTases), que metilato de DNA 7, 8 RNA, proteínas 9, ou pequenas moléculas 10. Dado o papel crucial das reações de metilação em diversos cenários fisiológicas (regulação de genes, a epigenética, o metabolismo), o perfil dos MTases se pode esperar para se tornar de importância similar em proteômica funcional como o perfil de quinases. Ferramentas analíticas para o seu perfil, no entanto, não estavam disponíveis. Recentemente, introduziu um CC com HAS como grupo seletividade para preencher esta lacuna tecnológica (Figura 1A). HAS, o produto da SAM, após a transferência de metila, é um inibidor produto conhecido geral MTase 11. Por esta razão e porque o natural cofactor SAM é usado pelas enzimas ainda a transferência de outras partes do cofator ou iniciar reações radicais, bem como devido à sua instabilidade química, 12 de HAS é uma função ideal para uma seletividade como alvo MTases CC. Aqui, relatamos a utilidade da HAS-CC e CCMS por MTases profiling e outros HAS proteínas de ligação a partir do DH5α estirpe de Escherichia coli (E. coli), um dos melhores caracterizados os procariontes, que tem servido como o modelo preferido organismo em inúmeros estudos bioquímicos, biológicos e biotecnológicos. Foto-ativada reticulação aumenta a produtividade e sensibilidade do experimento, a especificidade e pode ser facilmente testada em experimentos de competição para usar um excesso de HAS livre.

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Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry CCMS

Compostos de captura são trifuncional pequenas moléculas para reduzir a complexidade do proteoma por funcionais reversíveis interação molécula de proteína pequena seguido por foto-reticulação e purificação. Aqui usamos um Composto de captura com<em&gt; S</em&gt;-Adenosil-<sub&gt; L</sub&gt;-Homocisteína vinculativo, como função de seletividade para isolar metiltransferases a partir de um<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Lisado de células inteiras e identificá-los pelo MS.

Perfil de metiltransferases e Outros S-Adenosil- L Homocisteína-Proteínas de Ligação de captura por Espectrometria de Massa Compound (CCMS)

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity ...

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Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS)

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