Name: profiling of methyltransferases and other s-adenosyl-l-homocysteine-binding proteins by capture compound mass spectrometry (ccms)
Uploaded: 2010-12-20T16:20:00
Duration: 17 min 12 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry CCMS at JoVE.com

Эта работа была поддержана Советом по правам пограничной науки Программа организации (HFSP Award 2007, RGP0058/2007-C). Мы благодарим профессор Ричард Робертс за инициирование проекта и за полезные обсуждения.

<ol>
	<li>Katayama, H., Oda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+proteomics+for+drug+discovery+based+on+compound-immobilized+affinity+chromatography.">Chemical proteomics for drug discovery based on compound-immobilized affinity chromatography.</a> J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 855, 21-27 (2007).</li><li>Barglow, K. T., Cravatt, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-based+protein+profiling+for+the+functional+annotation+of+enzymes.">Activity-based protein profiling for the functional annotation of enzymes.</a> Nat. Methods. 4, 822-827 (2007).</li><li>Koster, H., Little, D. P., Luan, P., Muller, R., Siddiqi, S. M., Marappan, S., Yip, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capture+compound+mass+spectrometry:+a+technology+for+the+investigation+of+small+molecule+protein+interactions.">Capture compound mass spectrometry: a technology for the investigation of small molecule protein interactions.</a> Assay Drug Dev. Technol. 5, 381-390 (2007).</li><li>Dalhoff, C., Hueben, M., Lenz, T., Poot, P., Nordhoff, E., Koster, H., Weinhold, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+S-Adenosyl-L-homocysteine+Capture+Compounds+for+Selective+Photoinduced+Isolation+of+Methyltransferases.">Synthesis of S-Adenosyl-L-homocysteine Capture Compounds for Selective Photoinduced Isolation of Methyltransferases.</a> ChemBioChem. 11, 256-265 (2010).</li><li>Lu, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S-Adenosylmethionine.">S-Adenosylmethionine.</a> Int. J. Biochem. Cell. Biol. 32, 391-3952 (2000).</li><li>Cantoni, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+methylation:+selected+aspects.">Biological methylation: selected aspects.</a> Annu. Rev. Biochem. 44, 435-451 (1975).</li><li>Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+Watson+and+Crick:+DNA+methylation+and+molecular+enzymology+of+DNA+methyltransferases.">Beyond Watson and Crick: DNA methylation and molecular enzymology of DNA methyltransferases.</a> ChemBioChem. 3, 274-293 (2002).</li><li>Chow, C. S., Lamichhane, T. N., Mahto, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+nucleotide+repertoire+of+the+ribosome+with+post-transcriptional+modifications.">Expanding the nucleotide repertoire of the ribosome with post-transcriptional modifications.</a> ACS Chem. Biol. 2, 610-619 (2007).</li><li>Grillo, M. A., Colombatto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S-Adenosylmethionine+and+protein+methylation.">S-Adenosylmethionine and protein methylation.</a> Amino Acids. 28, 357-362 (2005).</li><li>Fujioka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+small+molecule+methyltransferases:+their+structural+and+functional+features.">Mammalian small molecule methyltransferases: their structural and functional features.</a> Int. J. Biochem. 24, 1917-1924 (1992).</li><li>Borchardt, R. T., Salvatore, F., Borek, E., Zappia, V., Williams-Ashman, H. G., Schlenk, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Biochemistry of S-Adenosylmethionine. , 151-171 (1977).</li><li>Hoffman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatographic+analysis+of+the+chiral+and+covalent+instability+of+S-adenosyl-l-methionine.">Chromatographic analysis of the chiral and covalent instability of S-adenosyl-l-methionine.</a> Biochemistry. 25, 4444-4449 (1986).</li><li>Keller, A., Nesvizhskii, A. I., Kolker, E., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Empirical+statistical+model+to+estimate+the+accuracy+of+peptide+identifications+made+by+MS/MS+and+database+search.">Empirical statistical model to estimate the accuracy of peptide identifications made by MS/MS and database search.</a> Anal. Chem. 74, 5383-5392 (2002).</li><li>Nesvizhskii, A. I., Keller, A., Kolker, E., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+statistical+model+for+identifying+proteins+by+tandem+mass+spectrometry.">A statistical model for identifying proteins by tandem mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 75, 4646-4658 (2003).</li></ol>

ThomasLenz, OliviaGrabner, MirkoGlinski, MathiasDreger и HubertKosterare используемых caprotec биоаналитики GmbH, Inc, которая производит некоторые реагенты, используемые в этой статье.

Следующие меры предосторожности и замечания могут быть полезны, когда после описанного протокола:) Главное преимущество СК заключается в образовании ковалентной связи между ЦК и MTase, так как это позволяет последующие жесткие условия стирки. Ковалентные сшивки достигается фотореакции вызваны ультрафиолетовым светом (310 нм максимум). Нормальный свет над головой содержит лишь небольшую часть УФ, однако, защитить SAH-CC с больше контакта с головой или даже солнечный свет до контролируемого облучения и охлаждается в caproBox. б) биологические образцы, из которых MTases должны быть изолированы может содержать белки склонны к денатурации, следовательно, необходимо в обязательном порядке сохранить образцы прохладно и, чтобы избежать вспенивания во все времена. в) caproBox охлаждения образцов до 0-4 ° С, излучающих ламп ультрафиолетового излучения, однако, также излучают тепло. Поэтому необходимо кратко центрифуги флаконов до облучения, так белков придерживаясь шапки или флакон стены не могут образовывать осадков семян. г) Если повторное приостановление магнитных шариков (например, в решениях мыть) невозможно вручную, вскоре применить ультразвук, помещая образцы в ультразвуковой ванне. д) Только что подготовить 0,2% TFA/60% АКС решение. Мы обнаружили, что в противном случае захваченных белков не может быть расщеплен из бисера. е) Окончательный анализ захваченных белков осуществляется LC-MS/MS. Масс-спектрометрия является высокочувствительным методом. Надо использовать исключительно LC-MS класса реагентов в заключительных шагов (шаг 2.11 и далее). Избегайте загрязнения экспериментов за счет внешних источников протеина, например, кератин, происходящих от пыли и от экспериментатора. Особенно на последнем шаге пищеварение, рекомендуется обратить внимание на чистое место работы, носить перчатки и халат и, возможно, сетку для волос или, в идеале выполняет заключительные шаги по чистой поверхности. Подготовка 50 мМ бикарбоната аммония буфер, используемый для триптического переварить в ЖК MS класса воды, процедить через фильтр 0,22 мкм, Алиготе, хранить при -20 ° С, и использовать каждую аликвоту только один раз, чтобы избежать загрязнения. Решение трипсина (секвенирование класса, Roche, подготовить 0,5 мкг / мкл раствора добавлением 1 мМ раствора для лиофилизированных трипсина) могут храниться при температуре 4 ° С в течение нескольких недель. г) Для получения надежных масс-спектры очень важно иметь стабильный спрей в анализе ESI-MS/MS. з) Для других систем LC-MS/MS, чем той, которая используется в настоящем исследовании, измерение параметров и алгоритмов идентификации пептида должны быть скорректированы в индивидуальном порядке. Следующие изменения возможны по отношению к описанным протоколом:) В качестве альтернативы к выпуску белков из бисера на 60% ACN/0.2% TFA (шаг 2,11), белков может быть непосредственно tryptically переваривается в бисер подвеска (тех же объемах, как в пункте 5.1) или, для SDS-PAGE, белки могут быть высвобождены путем приостановления и отопления бусин собраны за шагом от 2,9 до 95 ° С в течение 10 мин в буфере образца SDS (как, вся подвеска или только супернатанта может быть загружена в гель карман). Мы обнаружили, что бусины медленно выделяют небольшое количество полимера в водном триптического решение переварить ходе проверок на борт триптического переварить даже после нескольких водных шаги стирки. Загрязнение полимера препятствует идентификации MS пептида и могут быть смыты бисера с использованием 80% ACN (по крайней мере три раза). После 80% шагов АКС мыть, бисер следует мыть один раз водой до на-бусинка триптического переварить. б) западные пятна использованием стрептавидином horseraddish пероксидазы и ECL подложки также можно использовать для визуализации успешных сшивание биотин содержащие ЦК белков. Поэтому или геля, полученного после шага 3,2 могут быть уничтожены или, так как чувствительность примерно в 10 раз выше, чем серебро окрашивание гелей, 10 мкл образцов после шагом 2,7 также может быть проанализирована иммуноблоттинга. Помните, что в последнем случае endogeneously биотинилированного белков также будут обнаружены, кроме белков искусственно биотинилированного от SAH-CC. в) Мы обнаружили, что это зависит от специальной системы (лизат, адресованное белков-мишеней, избирательность и реакционная функции он CC), будь то &quot;вне шарик&quot; конфигурации, где сшивание происходит реакция между свободными CC и белков в растворе 4 или в настоящее время описано &quot;на борт&quot; конфигурации (рис. 1В) работает лучше. В общем, метод также должна быть совместима с любым государством-оф-арт стабильный изотоп белка или пептида технологии маркировки, или оценки захвата образца 2D гель-электрофореза. В &quot;вне шарик&quot; конфигурации, возможно также захватить белки в течение целых клеток (неопубликованные результаты). Кроме того, препарат или кофактора сайт связывания белка можно выделить путем определения двух шагах от сшивания позиции ЦК в белковой последовательности, с помощью секвенирования MS пептида. Режим привязки небольшой молекулы белка могут быть изучены с использованием различных сhemical позиции вложений в функции селективности и различными компоновщик длины. Как показано в настоящем исследовании, также связывается с белками партнеров белки рассмотрены селективность функции (RplK как субстрат PrmA) или неизвестных маленькой молекулы белковых взаимодействий (САК для GlnA) могут быть идентифицированы. Обобщенная, дополнительная особенность СК, фото-сшивающие реактивности, дает возможность выделения и идентификации белков низкой обильные или функциональных белковых семейств из сложных смесей белков с высокой чувствительностью и обеспечивает ученых дополнительным инструментом для изучения малых молекул - белковых взаимодействий .

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>SAH caproKit&trade;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>caprotec bioanalytics GmbH</td>
<td>1-1010-050 (50 reactions) 1-1010-010 (10 reactions)</td>
<td>Includes the SAH-CC, SAH competitor, streptavidin coated magnetic beads, capture buffer, and wash buffer</td>
</tr>
<tr>
<td>caproBox&trade;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>caprotec bioanalytics GmbH</td>
<td>1-5010-003 (110 V) 1-5010-004 (230 V)</td>
<td>For reproducible photo-activation while cooling the samples</td>
</tr>
<tr>
<td>caproMag&trade;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>caprotec bioanalytics GmbH</td>
<td>1-5100-001</td>
<td>For easy handling of magnetic particles without pipetting</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

profiling of methyltransferases and other s-adenosyl-l-homocysteine-binding proteins by capture compound mass spectrometry (ccms)

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity chromatography 1 or Activity Based Protein Profiling 2. Trifunctional Capture Compounds (CCs, Figure 1A) 3 are the basis for a generic approach, in which the initial equilibrium-driven interaction between a small molecule probe (the selectivity function, here S-adenosyl-L-homocysteine, SAH, Figure 1A) and target proteins is irreversibly fixed upon photo-crosslinking between an independent photo-activable reactivity function (here a phenylazide) of the CC and the surface of the target proteins. The sorting function (here biotin) serves to isolate the CC - protein conjugates from complex biological mixtures with the help of a solid phase (here streptavidin magnetic beads). Two configurations of the experiments are possible: "off-bead" 4 or the presently described "on-bead" configuration (Figure 1B). The selectivity function may be virtually any small molecule of interest (substrates, inhibitors, drug molecules).
S-Adenosyl-L-methionine (SAM, Figure 1A) is probably, second to ATP, the most widely used cofactor in nature 5, 6. It is used as the major methyl group donor in all living organisms with the chemical reaction being catalyzed by SAM-dependent methyltransferases (MTases), which methylate DNA 7, RNA 8, proteins 9, or small molecules 10. Given the crucial role of methylation reactions in diverse physiological scenarios (gene regulation, epigenetics, metabolism), the profiling of MTases can be expected to become of similar importance in functional proteomics as the profiling of kinases. Analytical tools for their profiling, however, have not been available. We recently introduced a CC with SAH as selectivity group to fill this technological gap (Figure 1A).
SAH, the product of SAM after methyl transfer, is a known general MTase product inhibitor 11. For this reason and because the natural cofactor SAM is used by further enzymes transferring other parts of the cofactor or initiating radical reactions as well as because of its chemical instability 12, SAH is an ideal selectivity function for a CC to target MTases. Here, we report the utility of the SAH-CC and CCMS by profiling MTases and other SAH-binding proteins from the strain DH5&alpha; of Escherichia coli (E. coli), one of the best-characterized prokaryotes, which has served as the preferred model organism in countless biochemical, biological, and biotechnological studies. Photo-activated crosslinking enhances yield and sensitivity of the experiment, and the specificity can be readily tested for in competition experiments using an excess of free SAH.

Watch this Scientific Journal Video about Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry CCMS at JoVE.com

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry CCMS

Захват Соединения трифункциональных малых молекул уменьшить сложность протеома функциональным обратимым маленькая молекула-белковых взаимодействий следуют фото-сшивания и очистки. Здесь мы используем Захват соединения с<em&gt; S</em&gt;-Аденозил-<sub&gt; L</sub&gt;-Гомоцистеин-обязательный характер, как избирательность функцию, чтобы изолировать от метилтрансферазы<em&gt; Кишечной палочки</em&gt; Целой клетки лизат и определить их государствами-членами.

Профилирование метилтрансферазы и других S-Аденозил- L-Гомоцистеин-связывающих белков Захват соединения масс-спектрометрия (CCMS)

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity ...

Research

JoVE Journal

Biology

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS)

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

MALDI пробоподготовки: ультра тонкий слой Метод

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Antibody Profiling by Luciferase Immunoprecipitation Systems (LIPS)

Antibody Profiling by Luciferase Immunoprecipitation Systems LIPS

Антитела профилирования по люциферазы Системы Иммунопреципитация (LIP)

Technologies for comprehensively understanding and quantifying antibody profiles to autoantigens and infectious agents may yield new insights into disease ...

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Анализ Большие белковые комплексы структурных масс-спектрометрии

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

OLIgo Mass Profiling (OLIMP) of Extracellular Polysaccharides

OLIgo Mass Profiling OLIMP of Extracellular Polysaccharides

Oligo массовой Профилирование (ОЛИМП) из внеклеточных полисахаридов

The direct contact of cells to the environment is mediated in many organisms by an extracellular matrix. One common aspect of extracellular matrices is ...

Atmospheric-pressure Molecular Imaging of Biological Tissues and Biofilms by LAESI Mass Spectrometry

Атмосферное давление молекулярной визуализации биологических тканей и биопленки на LAESI масс-спектрометрии

Ambient ionization methods in mass spectrometry allow analytical investigations to be performed directly on a tissue or biofilm under native-like ...

Direct Analysis of Single Cells by Mass Spectrometry at Atmospheric Pressure

Прямой анализ отдельных клеток методом масс-спектрометрии при атмосферном давлении

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

Количественная оценка Белки Использование пептидов обогащению иммуноаффинной В сочетании с масс-спектрометрии

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry

Профилирование тиоловых Редокс Протеом Использование изотопной масс-спектрометрии тегов

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on ...

Capture Compound Mass Spectrometry - A Powerful Tool to Identify Novel c-di-GMP Effector Proteins

Захват соединения масс-спектрометрия - мощный инструмент для идентификации новых гр-ди-GMP эффекторных белков

Considerable progress has been made during the last decade towards the identification and characterization of enzymes involved in the synthesis ...

Sequence-specific Labeling of Nucleic Acids and Proteins with Methyltransferases and Cofactor Analogues

Последовательность конкретных Маркировка нуклеиновых кислот и белков с метилтрансферазы и кофактора аналогов

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific ...