Name: profiling of methyltransferases and other s-adenosyl-l-homocysteine-binding proteins by capture compound mass spectrometry (ccms)
Uploaded: 2010-12-20T16:20:00
Duration: 17 min 12 s
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Este trabajo fue apoyado por la organización del programa Human Frontier Science (Premio HFSP 2007, RGP0058/2007-C). Damos las gracias al profesor Richard Roberts para iniciar el proyecto y para un debate fructífero.

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ThomasLenz, OliviaGrabner, MirkoGlinski, MathiasDreger y HubertKosterare empleados por caprotec bioanalítica GmbH, Inc, que produce algunos de los reactivos utilizados en este artículo.

Las siguientes precauciones y comentarios pueden ser útiles cuando se sigue el protocolo descrito: a) Una de las principales ventajas de los países candidatos se encuentra en la formación de un enlace covalente entre la CC y la MTase, ya que esto permite posteriores condiciones de lavado rigurosas. El entrecruzamiento covalente se logra mediante un fotorreacción provocado por la luz UV (310 nm máx.). Luz del techo normal contiene sólo una pequeña fracción de la radiación UV, sin embargo, la protección del SAH-CC de una mayor exposición a la luz de arriba o incluso el sol hasta la irradiación controlada y se enfría en el caproBox. b) Las muestras biológicas de las que el MTases deben ser aisladas pueden contener proteínas propensas a la desnaturalización, por lo tanto es obligatorio para mantener las muestras frescas y evitar la formación de espuma en todo momento. c) El caproBox enfría las muestras a 0-4 º C, las lámparas que emiten la luz UV, sin embargo, también emiten calor. Por lo tanto, es necesario centrifugar brevemente los viales antes de la irradiación, por lo que las proteínas de adhesión a las tapas o paredes del vial no puede formar semillas precipitación. d) Si la resuspensión de las partículas magnéticas (por ejemplo, en las soluciones de lavado), no es posible con la mano, poco se aplican ultrasonidos mediante la colocación de las muestras en un baño de ultrasonidos. e) Recién preparar el 0,2% de solución TFA/60% ACN. Se encontró que de otra manera las proteínas capturados no pueden ser escindidos de las cuentas. f) El análisis final de las proteínas de captura se lleva a cabo por LC-MS/MS. Espectrometría de masas es un método altamente sensible. Es necesario el uso de reactivos exclusivamente LC-MS de grado en los últimos pasos (paso 2.11 y más). Evitar la contaminación de los experimentos de las fuentes de proteínas externas, por ejemplo, la queratina de origen del polvo o del experimentador. Especialmente durante las etapas de la digestión final, se recomienda prestar atención a un espacio de trabajo limpio, usar guantes y una bata de laboratorio y, posiblemente, una redecilla para el pelo o, idealmente, realizar los pasos finales en un banco limpio. Prepare los 50 mM bicarbonato de amonio utilizado para digerir tríptico en LC MS agua grado, el filtro a través de filtro de 0,22 micras, alícuota, almacenar a -20 ° C, y el uso cada alícuota sólo una vez para evitar la contaminación. La solución de tripsina (secuenciación de grado, Roche, preparar un 0,5 mg / l solución mediante la adición de HCl 1 mM de liofilizado tripsina) se puede almacenar a 4 ° C durante varias semanas. g) Para obtener los espectros de masas confiable es esencial contar con un aerosol estable en el análisis de ESI-MS/MS. h) Para los sistemas de LC-MS/MS que no sea la utilizada en el presente estudio, los parámetros de medición y los algoritmos de identificación de péptidos debe ajustarse individualmente. Las siguientes modificaciones son posibles con respecto al protocolo descrito: a) Como alternativa a la liberación de las proteínas de los granos por TFA 60% ACN/0.2% (paso 2,11), las proteínas pueden ser digeridos directamente tryptically dentro de una suspensión de bolas (mismos volúmenes que en el paso 5.1) o, por SDS-PAGE, las proteínas pueden ser liberados por la suspensión y calefacción las cuentas recogidas después del paso desde 2,9 hasta 95 ° C durante 10 minutos en tampón de muestra SDS (tanto, la suspensión total o sólo el sobrenadante se puede cargar en la bolsa de gel). Se encontró que las cuentas lentamente liberan pequeñas cantidades de polímero en la solución acuosa tríptico resumen en el tríptico resumen de cuentas-incluso después de varias etapas de lavado acuoso. La contaminación interfiere con polímero MS identificación de péptidos y se puede lavar las cuentas usando el 80% ACN (por lo menos tres veces). Después de las etapas de lavado del 80% de ACN, los granos deben ser lavados una vez con agua antes de que el tríptico resumen de perlas. b) Las transferencias Western utilizando estreptavidina-peroxidasa y sustrato horseraddish ECL también se puede utilizar para visualizar la reticulación éxito de la CC contiene biotina a las proteínas. Por lo tanto, ya sea el gel obtenido al paso 3.2 se puede borrar o, debido a que la sensibilidad es de aproximadamente 10 veces mayor que la tinción de plata de los geles, las muestras de 10 l después del paso 2.7 también pueden ser analizados por Western blot. Cuenta que en este último caso las proteínas endógenamente biotina también se detectó, además de las proteínas con biotina artificialmente por la SAH-CC. c) Se encontró que depende del régimen especial (lisado, se dirigió a proteínas diana, la selectividad y la función de la reactividad de que CC), si el &quot;off-talón&quot; de configuración, donde la reacción de reticulación se lleva a cabo entre el CC y libre de proteínas en solución al 4 o el que actualmente se describe &quot;en bolas&quot; de configuración (fig. 1B) tiene un mejor rendimiento. En general, el método debe ser compatible con cualquier estado de la proteína de isótopos estables de arte o la tecnología de etiquetado de péptido, o la evaluación de la muestra de la captura por electroforesis en gel 2D. En el &quot;off-talón&quot; de configuración, también es posible la captura de las proteínas dentro de células enteras (resultados no publicados). Además, la droga o en el sitio cofactor unión de una proteína puede ser descrito mediante la determinación de la posición de entrecruzamiento de cerca por el de la CC en la secuencia de la proteína por los Estados miembros la secuenciación de péptidos. El modo de unión de una molécula pequeña que una proteína puede ser explorado por el uso de diferentes cposiciones hemical apego a la función de selectividad y las diferentes longitudes de enlace. Como se muestra en el presente estudio, también se asocia la proteína de unión de las proteínas dirigidas por la función de selectividad (RplK como sustrato de PRMA) o desconocidas interacciones pequeña molécula de proteína (HSA a glnA) se pueden identificar. Resumen, la característica adicional de los países candidatos, la reactividad de la foto-reticulación, permite el aislamiento e identificación de proteínas de bajo abundantes o familias funcionales de proteínas a partir de mezclas complejas de proteínas con alta sensibilidad y proporciona a los científicos una herramienta adicional para el estudio de moléculas pequeñas - las interacciones proteína .

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>SAH caproKit&trade;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>caprotec bioanalytics GmbH</td>
<td>1-1010-050 (50 reactions) 1-1010-010 (10 reactions)</td>
<td>Includes the SAH-CC, SAH competitor, streptavidin coated magnetic beads, capture buffer, and wash buffer</td>
</tr>
<tr>
<td>caproBox&trade;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>caprotec bioanalytics GmbH</td>
<td>1-5010-003 (110 V) 1-5010-004 (230 V)</td>
<td>For reproducible photo-activation while cooling the samples</td>
</tr>
<tr>
<td>caproMag&trade;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>caprotec bioanalytics GmbH</td>
<td>1-5100-001</td>
<td>For easy handling of magnetic particles without pipetting</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

profiling of methyltransferases and other s-adenosyl-l-homocysteine-binding proteins by capture compound mass spectrometry (ccms)

Hay una variedad de enfoques para reducir la complejidad del proteoma de la base de la pequeña molécula de proteína funcional interacciones, tales como la cromatografía de afinidad o de una actividad de generación de perfiles basados ​​en las proteínas 2. Los compuestos trifuncionales Captura (CC, Figura 1) 3 son la base para un enfoque genérico, en el que el equilibrio inicial impulsada por la interacción entre una sonda pequeña molécula (la función de selectividad, aquí S-adenosil-L-homocisteína, HSA, Figura 1 A) y proteínas de la meta es irreversible fija en la foto-entrecruzamiento entre una función de reacción independiente de foto-activable (en este caso un phenylazide) de la CC y la superficie de las proteínas diana. La función de clasificación (en este caso biotina) sirve para aislar la CC - conjugados de mezclas complejas biológicas con la ayuda de una fase sólida (en este caso cuentas estreptavidina magnética). Dos configuraciones de los experimentos son posibles: &quot;en bolas&quot; 4 o el descrito en la actualidad &quot;en bolas&quot; de configuración (fig. 1B). La función de selectividad puede ser prácticamente cualquier molécula pequeña de interés (sustratos, inhibidores de moléculas de la droga). S-adenosil-L-metionina (SAM, Figura 1) es, probablemente, el segundo de la ATP, el cofactor más utilizado en la naturaleza 5, 6. Se utiliza como donante metilo de los grupos principales en todos los organismos vivos con la reacción química catalizada por ser SAM-dependiente metiltransferasas (MTases), que metilato ADN 7, 8 ARN, proteínas 9, o pequeñas moléculas 10. Dado el papel crucial de las reacciones de metilación en diversos escenarios fisiológicos (regulación génica, epigenética, el metabolismo), los perfiles de MTases se puede esperar a ser de importancia similar en la proteómica funcional como el perfil de las quinasas. Herramientas analíticas para su perfil, sin embargo, no han estado disponibles. Recientemente hemos introducido un CC con HSA como grupo de selectividad para llenar este vacío tecnológico (Figura 1). SAH, el producto de la malnutrición aguda después de la transferencia de metilo, es un conocido inhibidor general de los productos MTase 11. Por esta razón y debido a que el cofactor natural de SAM es utilizada por las enzimas más la transferencia de otras partes del cofactor o iniciar reacciones de los radicales, así como debido a su inestabilidad química 12, HSA es una función de selectividad ideal para una CC a MTases objetivo. En este sentido, el informe de la utilidad de la HSA-CC y los MCP por MTases perfiles y otras proteínas de unión a HSA de la DH5a cepa de Escherichia coli (E. coli), una de las mejor caracterizadas de los procariotas, que ha servido como el modelo preferido organismo en un sinnúmero de estudios bioquímicos, biológicos y biotecnológicos. Foto activado reticulación mejora el rendimiento y la sensibilidad del experimento, y la especificidad se puede probar fácilmente en experimentos de competición con un exceso de libertad HSA.

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Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry CCMS

Los compuestos de captura se trifuncional pequeñas moléculas para reducir la complejidad del proteoma de funcionamiento reversible de moléculas pequeñas, la interacción de proteínas seguido por foto-reticulación y la purificación. Aquí se utiliza un compuesto de captura con<em&gt; S</em&gt;-Adenosil-<sub&gt; L</sub&gt;-Homocisteína vinculante como función de selectividad para aislar metiltransferasas de un<em&gt; Escherichia coli</emCelular&gt; toda lisado e identificarlos por los Estados miembros.

Perfiles de metiltransferasas y Otros S-Adenosil- L-Homocisteína proteínas que se unen mediante espectrometría de masas de captura compuesto (MCP)

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity ...

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