Name: profiling of methyltransferases and other s-adenosyl-l-homocysteine-binding proteins by capture compound mass spectrometry (ccms)
Uploaded: 2010-12-20T16:20:00
Duration: 17 min 12 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry CCMS at JoVE.com

Detta arbete stöddes av Human Frontier Science Program Organization (HFSP Award 2007, RGP0058/2007-C). Vi tackar Prof. Richard Roberts för att initiera projektet och för givande diskussioner.

<ol>
	<li>Katayama, H., Oda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+proteomics+for+drug+discovery+based+on+compound-immobilized+affinity+chromatography.">Chemical proteomics for drug discovery based on compound-immobilized affinity chromatography.</a> J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 855, 21-27 (2007).</li><li>Barglow, K. T., Cravatt, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-based+protein+profiling+for+the+functional+annotation+of+enzymes.">Activity-based protein profiling for the functional annotation of enzymes.</a> Nat. Methods. 4, 822-827 (2007).</li><li>Koster, H., Little, D. P., Luan, P., Muller, R., Siddiqi, S. M., Marappan, S., Yip, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capture+compound+mass+spectrometry:+a+technology+for+the+investigation+of+small+molecule+protein+interactions.">Capture compound mass spectrometry: a technology for the investigation of small molecule protein interactions.</a> Assay Drug Dev. Technol. 5, 381-390 (2007).</li><li>Dalhoff, C., Hueben, M., Lenz, T., Poot, P., Nordhoff, E., Koster, H., Weinhold, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+S-Adenosyl-L-homocysteine+Capture+Compounds+for+Selective+Photoinduced+Isolation+of+Methyltransferases.">Synthesis of S-Adenosyl-L-homocysteine Capture Compounds for Selective Photoinduced Isolation of Methyltransferases.</a> ChemBioChem. 11, 256-265 (2010).</li><li>Lu, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S-Adenosylmethionine.">S-Adenosylmethionine.</a> Int. J. Biochem. Cell. Biol. 32, 391-3952 (2000).</li><li>Cantoni, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+methylation:+selected+aspects.">Biological methylation: selected aspects.</a> Annu. Rev. Biochem. 44, 435-451 (1975).</li><li>Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+Watson+and+Crick:+DNA+methylation+and+molecular+enzymology+of+DNA+methyltransferases.">Beyond Watson and Crick: DNA methylation and molecular enzymology of DNA methyltransferases.</a> ChemBioChem. 3, 274-293 (2002).</li><li>Chow, C. S., Lamichhane, T. N., Mahto, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+nucleotide+repertoire+of+the+ribosome+with+post-transcriptional+modifications.">Expanding the nucleotide repertoire of the ribosome with post-transcriptional modifications.</a> ACS Chem. Biol. 2, 610-619 (2007).</li><li>Grillo, M. A., Colombatto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S-Adenosylmethionine+and+protein+methylation.">S-Adenosylmethionine and protein methylation.</a> Amino Acids. 28, 357-362 (2005).</li><li>Fujioka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+small+molecule+methyltransferases:+their+structural+and+functional+features.">Mammalian small molecule methyltransferases: their structural and functional features.</a> Int. J. Biochem. 24, 1917-1924 (1992).</li><li>Borchardt, R. T., Salvatore, F., Borek, E., Zappia, V., Williams-Ashman, H. G., Schlenk, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Biochemistry of S-Adenosylmethionine. , 151-171 (1977).</li><li>Hoffman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatographic+analysis+of+the+chiral+and+covalent+instability+of+S-adenosyl-l-methionine.">Chromatographic analysis of the chiral and covalent instability of S-adenosyl-l-methionine.</a> Biochemistry. 25, 4444-4449 (1986).</li><li>Keller, A., Nesvizhskii, A. I., Kolker, E., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Empirical+statistical+model+to+estimate+the+accuracy+of+peptide+identifications+made+by+MS/MS+and+database+search.">Empirical statistical model to estimate the accuracy of peptide identifications made by MS/MS and database search.</a> Anal. Chem. 74, 5383-5392 (2002).</li><li>Nesvizhskii, A. I., Keller, A., Kolker, E., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+statistical+model+for+identifying+proteins+by+tandem+mass+spectrometry.">A statistical model for identifying proteins by tandem mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 75, 4646-4658 (2003).</li></ol>

ThomasLenz, OliviaGrabner, MirkoGlinski, MathiasDreger och HubertKosterare anställd caprotec bioanalytics GmbH, Inc som producerar några av de reagenser som används i denna artikel.

Följande försiktighetsåtgärder och kommentarer kan vara användbart när man följer den beskrivna protokoll: a) En stor fördel av CCS ligger i bildandet av en kovalent bindning mellan CC och MTase, eftersom detta tillåter efterföljande stränga tvätt förhållanden. Den kovalenta Crosslink uppnås genom en photoreaction utlöses av UV-ljus (310 nm max.). Normal överljus innehåller endast en liten del av UV dock skydda SAH-CC från längre exponering för overhead eller ens solljus upp till den kontrollerade och kyls bestrålning i caproBox. b) biologiska prover från vilken MTases ska isoleras kan innehålla proteiner benägen att denaturering, därför är det obligatoriskt att hålla proverna svalt och för att undvika skumbildning vid alla tillfällen. c) caproBox kyler proverna till 0-4 ° C, lamporna avger UV-ljus, men också avger värme. Därför är det nödvändigt att kort centrifugera ampullerna före bestrålning, så proteiner som ansluter sig till Caps eller väggar flaskan kan inte bilda nederbörd frön. d) Om resuspension av magnetiska kulor (t.ex. i tvätt-lösningar) är inte möjligt för hand, inom kort ansöka ultraljud genom att placera prover i ett ultraljudsbad. e) Färskt förbereda 0,2% TFA/60% ACN lösning. Vi fann att annars fångade proteiner inte kan klyvas från pärlor. f) Den slutliga analysen av tillfångatagna proteiner utförs av LC-MS/MS. Masspektrometri är en mycket känslig metod. Det är nödvändigt att använda uteslutande LC-MS-grade reagenser i de sista stegen (steg 2,11 och vidare). Undvika kontaminering av experiment av externa proteinkällor, t.ex. keratin härrör från damm eller från försöksledaren. Särskilt under de sista matsmältningen stegen, rekommenderas att uppmärksamma en ren arbetsplats, att bära handskar och en skyddsrock och eventuellt ett hårnät eller helst utför de sista stegen i en ren bänk. Förbered 50 mM buffert ammoniumbikarbonat används för Tryptic smälta i LC MS årskurs vatten, filtrera genom 0,22 ìm filter, delprov, lagra vid -20 ° C, och använda varje alikvot endast en gång för att undvika föroreningar. Den trypsin lösningen (sekvensering grad, Roche, förbereda en 0,5 mikrogram / l lösning genom att tillsätta 1 mM HCl till frystorkad trypsin) kan lagras vid 4 ° C i flera veckor. g) För att få tillförlitlig masspektra är det viktigt att ha en stabil spray i ESI-MS/MS analys. h) För andra LC-MS/MS system än den som användes i denna studie, måste mätparametrar och peptid algoritmer identifiering justeras individuellt. Följande ändringar är möjliga med hänsyn till den beskrivna protokollet: a) Alternativt att släppa proteiner från kulorna med 60% ACN/0.2% TFA (steg 2,11), kan de proteiner direkt tryptically rötas i en pärla suspension (samma volymer som i steg 5.1) eller, för SDS-PAGE, kan de proteiner frigöras genom att avbryta och värme kulorna samlas efter steg från 2,9 till 95 ° C i 10 min i SDS prov buffert (båda, hela avstängning eller bara supernatanten kan lastas in gelen fickan). Vi fann att kulorna sakta släppa små mängder av polymer i vattenlösning Tryptic smälta lösning under on-pärla Tryptic smälta även efter flera vattenlösning tvätt steg. Polymeren föroreningar stör MS peptid identifiering och kan tvättas bort kulorna med 80% ACN (minst tre gånger). Efter 80% steg ACN tvätta, bör pärlorna tvättas en gång med vatten före på pärla Tryptic smälta. b) Western blotting med streptavidin-horseraddish peroxidas och ECL-substrat kan också användas för att visualisera framgångsrika crosslinking av biotin innehåller CC till proteiner. Därför antingen gel som erhålls efter steg 3,2 kan utplånas, eller, eftersom känsligheten är ca 10 gånger högre än silver färgning av geler, får 10 ìl prover efter steg 2,7 också analyseras med Western blot. Ihåg att i det senare fallet endogeneously biotinylerad proteiner också kan upptäckas förutom proteiner artificiellt biotinylerad av SAH-CC. c) Vi fann att det beror på det särskilda systemet (lysat, riktat målproteiner, selektivitet och reaktivitet funktion han CC), om &quot;off-pärla&quot; konfiguration, där crosslinking reaktionen sker mellan fria CC och protein i lösning 4 eller för närvarande beskrivs &quot;on-kula&quot; konfiguration (Figur 1B) presterar bättre. I allmänhet bör metoden även kompatibel med alla state-of-the art stabila isotopen protein eller peptid märkning teknik, eller bedömning av den fånga provet genom 2D gelelektrofores. I &quot;off-pärla&quot; konfiguration, är det också möjligt att fånga proteiner inom hela celler (opublicerade resultat). Dessutom kan läkemedel eller kofaktor bindande platsen av ett protein att anges genom att bestämma den närbelägna crosslinking positionen för CC inom proteinsekvens av MS peptid sekvensering. Bindningen läge för en liten molekyl till ett protein som kan utforskas med hjälp av olika chemical fastsättning befattningar på selektivitet funktion och olika länkare längder. Som visas i den aktuella studien, tog även proteinbindning partner i de proteiner som selektivitet funktion (RplK som substrat för PrmA) eller okänd liten molekyl interaktioner protein (SAH till GlnA) kan identifieras. Sammanfattas, ytterligare inslag av CCS, foto-crosslinking reaktivitet, möjliggör isolering och identifiering av låg rikligt proteiner eller funktionella familjer protein från komplexa protein blandningar med hög känslighet och ger forskare med ytterligare ett verktyg för att studera små molekyler - protein interaktioner .

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>SAH caproKit&trade;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>caprotec bioanalytics GmbH</td>
<td>1-1010-050 (50 reactions) 1-1010-010 (10 reactions)</td>
<td>Includes the SAH-CC, SAH competitor, streptavidin coated magnetic beads, capture buffer, and wash buffer</td>
</tr>
<tr>
<td>caproBox&trade;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>caprotec bioanalytics GmbH</td>
<td>1-5010-003 (110 V) 1-5010-004 (230 V)</td>
<td>For reproducible photo-activation while cooling the samples</td>
</tr>
<tr>
<td>caproMag&trade;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>caprotec bioanalytics GmbH</td>
<td>1-5100-001</td>
<td>For easy handling of magnetic particles without pipetting</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

profiling of methyltransferases and other s-adenosyl-l-homocysteine-binding proteins by capture compound mass spectrometry (ccms)

Det finns en rad olika modeller för att minska komplexiteten i de proteomet på grundval av funktionella liten molekyl-protein interaktioner som t.ex. affinitetskromatografi 1 eller Activity Based Protein profilering 2. Trifunctional Capture föreningar (CCS, Figur 1A) 3 är grunden för en generisk metod, där den initiala jämvikten driven samverkan mellan en liten molekyl sond (selektivitet funktionen, här S-adenosyl-L-homocystein, SAH, Figur 1A) och målproteiner är oåterkalleligen fast på foto-crosslinking mellan en oberoende foto-aktiverbara reaktivitet funktion (här en phenylazide) av CC och ytan av målproteiner. Sorteringen funktion (här biotin) tjänar till att isolera CC - protein konjugat från komplexa biologiska blandningar med hjälp av en fast fas (här streptavidin magnetiska kulor). Två konfigurationer av experiment är möjliga: &quot;off-pärla&quot; 4 eller nu beskrivna &quot;on-kula&quot; konfiguration (Figur 1B). Selektiviteten funktion kan praktiskt taget alla liten molekyl av intresse (substrat, hämmare, läkemedelsmolekyler). S-adenosyl-L-metionin (SAM, Figur 1A) är förmodligen andra till ATP, den mest använda kofaktor i naturen 5, 6. Det används som den största metylgruppsdonator i alla levande organismer med den kemiska reaktionen som katalyseras av SAM-beroende metyltransferaser (MTases), som metanollösning DNA-7, RNA 8, 9 proteiner eller små molekyler 10. Med tanke på den avgörande roll som metylering reaktioner i olika fysiologiska scenarier (genreglering, epigenetik, metabolism), kan profilering av MTases förväntas bli av lika stor betydelse i funktionell proteomik som profilering av kinaser. Analytiska verktyg för profilering, dock inte varit tillgängliga. Vi införde nyligen en CC med SAH som selektivitet grupp för att fylla detta teknologiska gapet (Figur 1A). SAH, produkten av SAM efter metyl överföring, är en känd allmän MTase produkt hämmare 11. Av denna anledning och eftersom den naturliga kofaktor SAM används av ytterligare enzymer överföra andra delar av kofaktor eller initiera radikala reaktioner samt på grund av dess kemiska instabilitet 12, är SAH en idealisk selektivitet funktion för en CC att rikta MTases. Här rapporterar vi nyttan av SAH-CC och CCMS genom att profilera MTases och andra SAH-bindande proteiner från stam DH5α av Escherichia coli (E. coli), en av de bästa karaktäriseras-prokaryoter, som har fungerat som den föredragna modellen organism i otaliga biokemiska, biologiska och biotekniska studier. Foto-aktiverade crosslinking förbättrar avkastningen och känsligheten i experimentet, och specificiteten kan lätt testas för i konkurrens experiment med ett överskott av fria SAH.

Watch this Scientific Journal Video about Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry CCMS at JoVE.com

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry CCMS

Fånga Föreningar är trifunctional små molekyler för att minska komplexiteten i de proteomet av funktionella reversibel liten molekyl-protein växelverkan följt av foto-crosslinking och rening. Här använder vi ett Capture förening med<em&gt; S</em&gt;-Adenosyl-<sub&gt; L</sub&gt;-Homocystein-bindande som selektivitet funktion för att isolera metyltransferaser från en<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Helcells lysat och identifiera dem med MS.

Profilering av metyltransferaser och andra S-Adenosyl- L-Homocystein-bindande proteiner av Capture Compound masspektrometri (CCMS)

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity ...

Research

JoVE Journal

Biology

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS)

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

MALDI Provberedning: Ultra tunt lager Metod

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Antibody Profiling by Luciferase Immunoprecipitation Systems (LIPS)

Antibody Profiling by Luciferase Immunoprecipitation Systems LIPS

Antikropp Profilering av luciferas Immunoprecipitation Systems (LIPS)

Technologies for comprehensively understanding and quantifying antibody profiles to autoantigens and infectious agents may yield new insights into disease ...

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Analysera stora proteinkomplex från struktur-masspektrometri

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

OLIgo Mass Profiling (OLIMP) of Extracellular Polysaccharides

OLIgo Mass Profiling OLIMP of Extracellular Polysaccharides

Oligo Mass profilering (OLIMP) av Extracellulär Polysackarider

The direct contact of cells to the environment is mediated in many organisms by an extracellular matrix. One common aspect of extracellular matrices is ...

Atmospheric-pressure Molecular Imaging of Biological Tissues and Biofilms by LAESI Mass Spectrometry

Atmosfäriskt tryck Molecular Imaging av biologisk vävnad och Biofilmer av LAESI masspektrometri

Ambient ionization methods in mass spectrometry allow analytical investigations to be performed directly on a tissue or biofilm under native-like ...

Direct Analysis of Single Cells by Mass Spectrometry at Atmospheric Pressure

Direkt analys av enskilda celler med masspektrometri vid atmosfärstryck

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

Kvantifiering av proteiner med Peptide Immunoaffinity Anrikning kombination med masspektrometri

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry

Profilering Tiol Redox Proteome Användning Isotope spektrometri Taggning Mäss

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on ...

Capture Compound Mass Spectrometry - A Powerful Tool to Identify Novel c-di-GMP Effector Proteins

Capture Compound masspektrometri - Ett kraftfullt verktyg för att identifiera nya c-di-GMP effektorproteiner

Considerable progress has been made during the last decade towards the identification and characterization of enzymes involved in the synthesis ...

Sequence-specific Labeling of Nucleic Acids and Proteins with Methyltransferases and Cofactor Analogues

Sekvensspecifik Märkning av nukleinsyror och proteiner med metyltransferaser och kofaktor Analogues

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific ...