Name: patch clamp and perfusion techniques for studying ion channels expressed in xenopus oocytes
Uploaded: 2011-01-10T18:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes at JoVE.com

Diese Arbeit wurde vom National Institutes of Health gewährt R01-HL70393 und R01-NS060706 zu JCJC unterstützt ist Professor für Biomedizinische Technik an der Spencer T. Olin Endowment.

1. Die Injektion von mRNA in Oozyten <ol><li> Inject von 0,05 bis 50 ng Boten-RNA, die in vitro in Xenopus laevis Oozyten (Stadium V-VI) mit Nanoject II Auto-Nanoliter Injector (Drummond Scientific Company, Modell 3-000-204) transkribiert wurde. Wiederholen Sie die Injektion auf ein Dutzend Eizellen für jede mRNA. </li><li> Spülen Sie den injizierten Oozyten zweimal mit ND-96-Lösung (96 mM Natriumchlorid (NaCl, Herr 58,44 g / mol), 2 mM Kaliumchlorid (KCl, Herr 74,56 g / mol), 1,8 mM Calciumchlori...

<ol>
	<li>Methfessel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+measurements+on+Xenopus+laevis+oocytes:+currents+through+endogenous+channels+and+implanted+acetylcholine+receptor+and+sodium+channels.">Patch clamp measurements on Xenopus laevis oocytes: currents through endogenous channels and implanted acetylcholine receptor and sodium channels.</a> Pfl&#252;gers Arch. 407, 577-588 (1986).</li><li>Toro, L., Wallner, M., Meera, P., Tanaka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maxi-K+(Ca),+Unique+Member+of+the+Voltage-Gated+K+Channel+Superfamily.">Maxi-K (Ca), Unique Member of the Voltage-Gated K Channel Superfamily.</a> News Physiol. Sci. 13, 112-117 (1998).</li><li>Fettiplace, R., Fuchs, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+hair+cell+tuning.">Mechanisms of hair cell tuning.</a> Annu. Rev. Physiol. 61, 809-834 (1999).</li><li>Du, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-sensitive+potassium+channelopathy+in+human+epilepsy+and+paroxysmal+movement+disorder.">Calcium-sensitive potassium channelopathy in human epilepsy and paroxysmal movement disorder.</a> Nat. Genet. 37, 733-738 (2005).</li><li>Ledoux, J., Werner, M. E., Brayden, J. E., Nelson, M. T., T, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-activated+potassium+channels+and+the+regulation+of+vascular+tone.">Calcium-activated potassium channels and the regulation of vascular tone.</a> Physiology (Bethesda). 21, 69-78 (2006).</li><li>Salkoff, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-conductance+potassium+channels+of+the+SLO+family.">High-conductance potassium channels of the SLO family.</a> Nat. Rev. Neurosci. 7, 921-931 (2006).</li><li>Shi, J., Cui, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Mg2++enhances+the+function+of+BK-type+Ca2+-activated+K++channels.">Intracellular Mg2+ enhances the function of BK-type Ca2+-activated K+ channels.</a> J. Gen. Physiol. 118, 589-606 (2001).</li><li>Magleby, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gating+mechanism+of+BK+(Slo1)+channels:+so+near,+yet+so+far.">Gating mechanism of BK (Slo1) channels: so near, yet so far.</a> J. Gen. Physiol. 121, 81-96 (2003).</li><li>Latorre, R., Brauchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+conductance+Ca2+-activated+K++(BK)+channel:+activation+by+Ca2++and+voltage.">Large conductance Ca2+-activated K+ (BK) channel: activation by Ca2+ and voltage.</a> Biol. Res. 39, 385-401 (2006).</li><li>Cox, D. H., Cui, J., Aldrich, R. W., W, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+gating+of+a+large+conductance+Ca-activated+K++channel.">Allosteric gating of a large conductance Ca-activated K+ channel.</a> J. Gen. Physiol. 110, 257-281 (1997).</li><li>Cui, J., Aldrich, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+linkage+between+voltage+and+Ca2+-dependent+activation+of+BK-type+mslo1.">Allosteric linkage between voltage and Ca2+-dependent activation of BK-type mslo1.</a> K+ channels. Biochemistry. 39, 15612-15619 (2000).</li><li>Yang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+Slo1+BK+channels+by+Mg2++coordinated+between+the+voltage+sensor+and+RCK1.">Activation of Slo1 BK channels by Mg2+ coordinated between the voltage sensor and RCK1.</a> 15, 1152-1159 (2008).</li><li>Lee, U. S., Cui, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term={beta}+subunit-specific+modulations+of+BK+channel+function+by+a+mutation+associated+with+epilepsy+and+dyskinesia.">{beta} subunit-specific modulations of BK channel function by a mutation associated with epilepsy and dyskinesia.</a> J. Physiol. , 587-1481 (2009).</li></ol>

Die Eizelle Ausdruck System ist ideal für elektrophysiologische Charakterisierung von spannungsabhängigen Ionenkanälen aufgrund der relativ niedrigen Hintergrund der endogenen Kanäle. Darüber hinaus, da es sich um eine vorübergehende Expression System ist, bietet es eine effiziente Methode zur Durchführung Mutagenesestudie dieser Kanäle. Es ist jedoch zu beachten, dass die Eizelle Expressionssystem anders als in Säugerzellen ist, so kann es Unterschiede in post-translationale Modifikation und Verknüpfung mit v...

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Nanoject II Auto-Nanoliter Injector</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Drummond Scientific Company</td>
<td>3-000-204</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instruments</td>
<td>P-97</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Perfusion System and Electronic Controller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>AutoMate Scientific, Inc.</td>
<td>ValveLink 16</td>
<td>Inner diameter of perfusion tip: 100 microns</td>
</tr>
<tr>
<td>Inverted Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>CKX31</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass Pipettes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR International</td>
<td>53432-921</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instrument Co.</td>
<td>P-97</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Amplifier</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Axon Instruments</td>
<td>AXOPATCH 200B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Computer Interface</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>INSTRUTECH Corporation</td>
<td>ITC-18</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Headstage</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Axon Instruments</td>
<td>CV 203BU</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

patch clamp and perfusion techniques for studying ion channels expressed in xenopus oocytes

Das Protokoll hier vorgestellten soll die Aktivierung der großen Leitfähigkeit, Spannungs-und Ca 2 +-aktivierten K + (BK) Kanäle zu studieren. Das Protokoll kann auch verwendet werden, um die Struktur-Funktions-Beziehung für andere Ionenkanäle und Neurotransmitter-Rezeptoren-1-Studie sein. BK-Kanäle sind weit verbreitet in verschiedenen Geweben exprimiert und haben in vielen physiologischen Funktionen, einschließlich der Regulierung der Kontraktion der glatten Muskulatur, Frequenzabstimmung von inneren Haarzellen und Regulierung der Freisetzung von Neurotransmittern 2-6 in Verbindung gebracht. BK-Kanäle werden durch Membran-Depolarisation und durch intrazelluläre Ca 2 + und Mg 2 + 6-9 aktiviert. Daher ist das Protokoll, mit dem sowohl die Membran-Spannung und die intrazelluläre Lösung zu kontrollieren. In diesem Protokoll wird Boten-RNA von BK-Kanälen in Xenopus laevis Oozyten (Stadium V-VI) von 2-5 Tagen Inkubation bei 18 ° C 10-13 gefolgt injiziert. Membrane Patches, die einzelne oder mehrere BK-Kanäle enthalten, werden mit der inside-out-Konfiguration mit Patch-Clamp-Techniken 10-13 herausgeschnitten. Die intrazellulären Seite der Patch mit der gewünschten Lösungen während der Aufnahme, so dass die Kanal-Aktivierung unter verschiedenen Bedingungen untersucht werden kann perfundiert. Zusammenfassend ist die mRNA von BK-Kanälen in Xenopus laevis Oozyten injiziert, um Kanal-Proteine ​​an der Eizelle Membran auszudrücken; Patch-Clamp-Techniken werden benutzt, um Ströme durch die Kanäle unter kontrollierten Spannung und intrazelluläre Lösungen aufnehmen.

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Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionenstrom von BK-Kanälen aufgezeichnet wird mit Patch-Clamp-Techniken. BK-Kanäle sind in Ausdruck<em&gt; Xenopus Oozyten</em&gt; Durch die Injektion von Boten-RNA. Die intrazelluläre Lösung während Patch Clamp Messungen wird durch eine Perfusion System gesteuert.

Patch-Clamp-und Perfusion Techniken zur Untersuchung von Ionenkanälen ausgedrückt in Xenopus Oozyten

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Research

JoVE Journal

Biology

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Methoden für die Patch-Clamp Kapazität Recordings aus dem Kelch

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Forschung

Biologie

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