Name: quantifying synapses: an immunocytochemistry-based assay to quantify synapse number
Uploaded: 2010-11-16T17:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Synapses: an Immunocytochemistry-based Assay to Quantify Synapse Number at JoVE.com

במעבדה של בן א בארס (אוניברסיטת סטנפורד).: Puncta Plug-in עבור תמונה J נכתב על ידי בארי ווארק (ייעוץ Physion הכתובת הנוכחית) Analyzer מימון; <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אלפרד פ &#39;סלואן קרן </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסתר א ויוסף Klingenstein קרן, Inc </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רחבה מחקר ביו קרן </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרופה יוזמת מחלת הנטינגטון s </li></ul>

פתרונות להכין: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נוגדן חוצץ: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 150 mM NaCl </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 50 מ&quot;מ טריס-Base (פישר, החתול לא:. BP152-5, 50 מ&quot;מ) - 1.21 גרם </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1% BSA (Sigma, חתול לא:. A2153, 1%) - 2.0 ג...

<ol>
	<li>Barres, B. A., Silverstein, B. E., Corey, D. P., Chun, L. L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological,+morphological,+and+electrophysiological+variation+among+retinal+ganglion+cells+purified+by+panning.">Immunological, morphological, and electrophysiological variation among retinal ganglion cells purified by panning.</a> Neuron. 1, 791-803 (1988).</li><li>Meyer-Franke, A., Kaplan, M. R., Pfrieger, F. W., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+signaling+interactions+that+promote+the+survival+and+growth+of+developing+retinal+ganglion+cells+in+culture.">Characterization of the signaling interactions that promote the survival and growth of developing retinal ganglion cells in culture.</a> Neuron. 15, 805-819 (1995).</li><li>Eroglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gabapentin+receptor+alpha2delta-1+is+a+neuronal+thrombospondin+receptor+responsible+for+excitatory+CNS+synaptogenesis.">Gabapentin receptor alpha2delta-1 is a neuronal thrombospondin receptor responsible for excitatory CNS synaptogenesis.</a> Cell. 139, 380-392 (2009).</li><li>Pfrieger, F. W., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+efficacy+enhanced+by+glial+cells+in+vitro.">Synaptic efficacy enhanced by glial cells in vitro.</a> Science. 277, 1684-1687 .</li><li>Ullian, E. M., Sapperstein, S. K., Christopherson, K. S., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+synapse+number+by+glia.">Control of synapse number by glia.</a> Science. 291, 657-661 (2001).</li><li>Christopherson, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombospondins+are+astrocyte-secreted+proteins+that+promote+CNS+synaptogenesis.">Thrombospondins are astrocyte-secreted proteins that promote CNS synaptogenesis.</a> Cell. 120, 421-433 (2005).</li><li>Godement, P., Salaun, J., Imbert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prenatal+and+postnatal+development+of+retinocollicular+projections+in+the+mouse.">Prenatal and postnatal development of retinocollicular projections in the mouse.</a> J. Comp. Neurol. 230, 552-575 (1985).</li><li>Schmidt, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+retinotopic+connections:+selective+stabilization+by+an+activity-dependent+mechanism.">Formation of retinotopic connections: selective stabilization by an activity-dependent mechanism.</a> Cell. Mol. Neurobiol. 5, 65-84 (1985).</li><li>Sachs, G. M., Jacobson, M., Caviness, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+changes+in+arborization+patterns+of+murine+retinocollicular+axons.">Postnatal changes in arborization patterns of murine retinocollicular axons.</a> J. Comp. Neurol. 246, 395-408 (1986).</li><li>Elmariah, S. B., Oh, E. J., Hughes, E. G., Balice-Gordon, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+regulate+inhibitory+synapse+formation+via+Trk-mediated+modulation+of+postsynaptic+GABAA+receptors.">Astrocytes regulate inhibitory synapse formation via Trk-mediated modulation of postsynaptic GABAA receptors.</a> J. Neurosci. 25, 3638-3650 (2005).</li><li>Hughes, E. G., Elmariah, S. B., Balice-Gordon, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+secreted+proteins+selectively+increase+hippocampal+GABAergic+length,+branching+and+synaptogenesis.">Astrocyte secreted proteins selectively increase hippocampal GABAergic length, branching and synaptogenesis.</a> Moll. Cell. Neurosci. 43, 136-145 (2010).</li></ol>

Assay סינפסה שתוארו לעיל מבוסס בהקשר של מטרות הניסוי שלנו, שבו אנו מתמקדים בעיקר על תחזיות מעוררות של RGCs, לא מטוהרים תרבות או בחלק המוח. סיפקנו שולחן התייחסות לרישום נוגדנים פועלות היטב עבור תיוג סינפסות מעוררות (טבלה 1). Assay זה סינפס?...

<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> אנטיגן </td><td> מין </td><td> חד שבטיים / polyclonal </td><td> מוכר </td><td> מספר קטלוגי </td><td> מהילה </td><td> יצירות תרבות </td><td> העבודות בסעיפים </td></tr><tr><td rowspan="10"> Presynaptic </td><td> Synapsin </td><td> ארנב </td><td> Polyclonal </td><td> Synaptic מערכות </td><td> 106004 </td><td> 1:750 </td><td> Y </td><td> ND </td></tr><tr><td> Synapsin </td><td> עכבר </td><td> חד שבטיים </td><td> Synaptic מערכות </td><td> 106001 </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr><tr><td> בסון </td><td> עכבר </td><td> חד שבטיים </td><td> Assay עיצובים </td><td> VAM-PS003F </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr><tr><td> בסון </td><td> קביה </td><td> Polyclonal </td><td> Synaptic מערכות </td><td> 141004 </td><td> 1:1000 </td><td> Y </td><td> ND </td></tr><tr><td> Synaptotagmin 1 </td><td> ארנב </td><td> Polyclonal </td><td> Synaptic מערכות </td><td> 105002 </td><td> 1:750 </td><td> Y </td><td> N </td></tr><tr><td> Synaptobrevin 2 (C1.69.1) </td><td> עכבר </td><td> חד שבטיים </td><td> Synaptic מערכות </td><td> 104211 </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr><tr><td> Synaptophysin (C1.7.2) </td><td> עכבר </td><td> חד שבטיים </td><td> Synaptic מערכות </td><td> 101011 </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr><tr><td> VGlut1 </td><td> עכבר </td><td> חד שבטיים </td><td> Millipore </td><td> MAB5502 </td><td> 1:2500 </td><td> N </td><td> Y </td></tr><tr><td> VGlut1 </td><td> קביה </td><td> Polyclonal </td><td> Millipore </td><td> AB5905 </td><td> 1:2500 </td><td> N </td><td> Y </td></tr><tr><td> VGlut2 </td><td> קביה </td><td> Polyclonal </td><td> Millipore </td><td> AB2251 </td><td> 1:2500 </td><td> N </td><td> Y </td></tr><tr><td rowspan="6"> Postsynaptic </td><td> PSD-95 (6G6 1C9-clone) </td><td> עכבר </td><td> חד שבטיים </td><td> זיקה ביו ריאגנטים </td><td> MA1-045 </td><td> 1:750 </td><td> Y </td><td> N </td></tr><tr><td> PSD-95 </td><td> ארנב </td><td> Polyclonal </td><td> Zymed </td><td> 51-6900 </td><td> 1:500 </td><td> N </td><td> Y </td></tr><tr><td> הומר </td><td> עכבר </td><td> חד שבטיים </td><td> Synaptic מערכות </td><td> 160011 </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> ND </td></tr><tr><td> הומר </td><td> עכברוש </td><td> Polyclonal </td><td> Millipore </td><td> AB5875 </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr><tr><td> Gephyrin </td><td> ארנב </td><td> Polyclonal </td><td> Synaptic מערכות </td><td> 147003 </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr><tr><td> Gephyrin </td><td> עכבר </td><td> חד שבטיים </td><td> Synaptic מערכות </td><td> 147 </td><td> 1:200 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr></tbody></table> טבלה 1: רשימת דוגמאות של סמנים טרום postsynaptic טוב שיש לנו מנוצל בהצלחה assay סינפסה שלנו. שימו לב כי זו אינה רשימה ממצה של כל סמנים זמינים. Y = כן, N = לא, ND = לא נקבע. <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מגיב </td><td> חברה </td><td> חתול. לא. </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 20012-027 </td></tr><tr><td> poly-d-ליזין </td><td> סיגמא </td><td> P6407 </td></tr><tr><td> Laminin </td><td> Cultrex </td><td> 3400-010-01 </td></tr><tr><td> טריטון X-100 </td><td> Roche Diagnostics GmbH </td><td> 9002-93-1 </td></tr><tr><td> עיזים רגיל סרום </td><td> Gibco </td><td> 16210 </td></tr><tr><td> VectaShield עם DAPI </td><td> וקטור מעבדות </td><td> H-1200 </td></tr><tr><td> אוקטובר </td><td> רקמות-Tek </td><td> 4583 </td></tr><tr><td> טריס-Base (50 מ&quot;מ) </td><td> דיג </td><td> BP152-5 </td></tr><tr><td> שור סרום אלבומין </td><td> סיגמא </td><td> A2153 </td></tr><tr><td> L-ליזין </td><td> סיגמא </td><td> L-1137 </td></tr><tr><td> 16% PFA פתרון </td><td> מיקרוסקופית אלקטרונים למדעים </td><td> 15711 </td></tr><tr><td> גרעיניים PFA </td><td> מיקרוסקופית אלקטרונים למדעים </td><td> 19210 </td></tr><tr><td> 24 גם תרבות צלחת </td><td> בז </td><td> 35-3047 </td></tr><tr><td> אנטי עכבר עיזים אלקסה נוגדנים מצומדות </td><td> Invitrogen </td><td> --- </td></tr><tr><td> אספקה </td><td> חברה </td><td> חתול. לא. </td></tr><tr><td> 12mm, מס &#39;0 זכוכית coverslips </td><td> קרל הכט GmbH </td><td> 1105209 </td></tr><tr><td> מס &#39;1.5 זכוכית coverslip (עבור פרוסות) </td><td> VWR מדעי </td><td> 48393241 </td></tr><tr><td> שקופיות הזכוכית </td><td> VWR מדעי </td><td> 48311-703 </td></tr></tbody></table>

quantifying synapses: an immunocytochemistry-based assay to quantify synapse number

אחת המטרות החשובות ביותר בחקר המוח היא להבין את הרמזים מולקולרית להורות כי בשלבים המוקדמים של היווצרות הסינפסה. ככזה זה הפך להיות הכרחי לפתח גישות אובייקטיבי לכמת שינויים קישוריות סינפטי. החל מ קיבעון המדגם, זה פרטים פרוטוקול איך לכמת את מספר הסינפסות הן בתרבות העצבית הפרידו בסעיפים המוח באמצעות immunocytochemistry. שימוש ספציפי תא נוגדנים, אנו תווית מסופי presynaptic כמו גם באתרים של התמחות postsynaptic. אנו מגדירים סינפסות כנקודות של colocalization בין האותות שנוצר על ידי סמנים אלה. מספר colocalizations אלה היא לכמת באמצעות תקע Puncta Analyzer (שנכתב על ידי Bary ווארק, זמין על פי דרישה, cellbio.duke.edu c.eroglu @) תחת פלטפורמת תוכנה לניתוח ImageJ. Assay סינפסה המתואר פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על כל הכנה או רקמה עצבית תרבות שעבורו יש לך סמנים טרום postsynaptic סלקטיבית. זה assay הסינפסה היא כלי רב ערך אשר יכול להיות מנוצל באופן נרחב במחקר של התפתחות הסינפטי.

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Synapses: an Immunocytochemistry-based Assay to Quantify Synapse Number at JoVE.com

Quantifying Synapses: an Immunocytochemistry-based Assay to Quantify Synapse Number

פרוטוקול זה מפרט כיצד לכמת את מספר הסינפסות הן בתרבות העצבית הפרידו בסעיפים המוח באמצעות immunocytochemistry. שימוש ספציפי תא נוגדנים, אנו תווית מסופי presynaptic כמו גם באתרים של התמחות postsynaptic. אנו מגדירים סינפסות כנקודות של colocalization בין האותות שנוצר על ידי סמנים אלה.

סינפסות כימות: Assay Immunocytochemistry מבוססי לכמת מספר סינפסה

One of the most important goals in neuroscience is to understand the molecular cues that instruct early stages of synapse formation. As such it has become ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

עצבית, המושבה יצירת Assay נייד: Assay להפלות בונה תאים בתום גזע עצביים מן ובתאים עצבית

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

An Engulfment Assay: A Protocol to Assess Interactions Between CNS Phagocytes and Neurons

Assay היבלעות: פרוטוקול להעריך אינטראקציות בין מערכת העצבים המרכזית וPhagocytes נוירונים

Phagocytosis is a process in which a cell engulfs material (entire cell, parts of a cell, debris, etc.) in its surrounding extracellular environment and ...

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

ניתוח ברזולוציה גבוהה כמותי immunogold של קולטני קרום ב סינפסות רצועת הכלים רשתית

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

שיטת אלקטרו עבור תגובות מתח תאיים הקלטה של<em&gt; תסיסנית</em&gt; קולטני אור ו interneurons יאירו גירויים<em&gt; In vivo</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila

Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila

Mass היסטולוגיה לכמת מוחיים ב<em&gt; תסיסנית</em

Progressive neurodegenerative diseases like Alzheimer&#39;s disease (AD) or Parkinson&#39;s disease (PD) are an increasing threat to human health ...

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

הערכה של צפיפות סינפסה פרוסות המוח מכרסמים בהיפוקמפוס

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...

Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

פיתוח assay על כימות תוכן גבוהה של היווצרות צבירה של מוטציה בחלבון Sod1 בתאים חיים

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc ...

Visualization of Thalamocortical Axon Branching and Synapse Formation in Organotypic Cocultures

ויזואליזציה של האקסון Thalamocortical הסתעפות, סינפסה-צורה Organotypic Cocultures

Axon branching and synapse formation are crucial processes for establishing precise neuronal circuits. During development, sensory thalamocortical (TC) ...

An Improved Method for Collection of Cerebrospinal Fluid from Anesthetized Mice

שיטה משופרת עבור אוסף של נוזל של עכברים מורדם

The cerebrospinal fluid (CSF) is a valuable body fluid for analysis in neuroscience research. It is one of the fluids in closest contact with the central ...

Purification of the Dendritic Filopodia-rich Fraction

טיהור של הדנדריטים הדנדריפיאה-חלק עשיר

Dendritic filopodia are thin and long protrusions based on the actin filament, and they extend and retract as if searching for a target axon. When the ...