Name: quantifying synapses: an immunocytochemistry-based assay to quantify synapse number
Uploaded: 2010-11-16T17:30:00
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Nel laboratorio di A. Ben Barres (Stanford University).: Puncta Plug-in per immagini è stata scritta da Barry J Wark (Consulting Physion attuale indirizzo) Analyzer Finanziamento; <ul><li> Alfred P. Sloan Foundation </li><li> A. Esther e Giuseppe Klingenstein Fund, Inc. </li><li> Broad Fondazione per la Ricerca Biomedica </li><li> Cura per la malattia di Huntington iniziativa s </li></ul>

Soluzioni da preparare: <ol><li> Anticorpi buffer: <ul><li> 150 mM NaCl </li><li> 50 mM Tris-Base (Fisher, Cat. No:. BP152-5, 50 mm) - 1,21 g </li><li> BSA 1% (Sigma, Cat. No:. A2153, 1%) - 2,0 g </li><li> 100 mM di L-lisina (Sigma, Cat. No:. L-1137, 100 mm) - 3,65 g </li><li> Regolare il pH a 7,4 </li><li> 0,04% azide </li><li> Regolare il volume a 200 ml con acqua distillata H 2 O. </li><li> Filtrare con filtro 0.22μm (Millipore, Cat. No:. SCGPU02RE). </li></ul></li><li> PFA Diluant: <ul><li> ...

<ol>
	<li>Barres, B. A., Silverstein, B. E., Corey, D. P., Chun, L. L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological,+morphological,+and+electrophysiological+variation+among+retinal+ganglion+cells+purified+by+panning.">Immunological, morphological, and electrophysiological variation among retinal ganglion cells purified by panning.</a> Neuron. 1, 791-803 (1988).</li><li>Meyer-Franke, A., Kaplan, M. R., Pfrieger, F. W., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+signaling+interactions+that+promote+the+survival+and+growth+of+developing+retinal+ganglion+cells+in+culture.">Characterization of the signaling interactions that promote the survival and growth of developing retinal ganglion cells in culture.</a> Neuron. 15, 805-819 (1995).</li><li>Eroglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gabapentin+receptor+alpha2delta-1+is+a+neuronal+thrombospondin+receptor+responsible+for+excitatory+CNS+synaptogenesis.">Gabapentin receptor alpha2delta-1 is a neuronal thrombospondin receptor responsible for excitatory CNS synaptogenesis.</a> Cell. 139, 380-392 (2009).</li><li>Pfrieger, F. W., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+efficacy+enhanced+by+glial+cells+in+vitro.">Synaptic efficacy enhanced by glial cells in vitro.</a> Science. 277, 1684-1687 .</li><li>Ullian, E. M., Sapperstein, S. K., Christopherson, K. S., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+synapse+number+by+glia.">Control of synapse number by glia.</a> Science. 291, 657-661 (2001).</li><li>Christopherson, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombospondins+are+astrocyte-secreted+proteins+that+promote+CNS+synaptogenesis.">Thrombospondins are astrocyte-secreted proteins that promote CNS synaptogenesis.</a> Cell. 120, 421-433 (2005).</li><li>Godement, P., Salaun, J., Imbert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prenatal+and+postnatal+development+of+retinocollicular+projections+in+the+mouse.">Prenatal and postnatal development of retinocollicular projections in the mouse.</a> J. Comp. Neurol. 230, 552-575 (1985).</li><li>Schmidt, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+retinotopic+connections:+selective+stabilization+by+an+activity-dependent+mechanism.">Formation of retinotopic connections: selective stabilization by an activity-dependent mechanism.</a> Cell. Mol. Neurobiol. 5, 65-84 (1985).</li><li>Sachs, G. M., Jacobson, M., Caviness, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+changes+in+arborization+patterns+of+murine+retinocollicular+axons.">Postnatal changes in arborization patterns of murine retinocollicular axons.</a> J. Comp. Neurol. 246, 395-408 (1986).</li><li>Elmariah, S. B., Oh, E. J., Hughes, E. G., Balice-Gordon, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+regulate+inhibitory+synapse+formation+via+Trk-mediated+modulation+of+postsynaptic+GABAA+receptors.">Astrocytes regulate inhibitory synapse formation via Trk-mediated modulation of postsynaptic GABAA receptors.</a> J. Neurosci. 25, 3638-3650 (2005).</li><li>Hughes, E. G., Elmariah, S. B., Balice-Gordon, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+secreted+proteins+selectively+increase+hippocampal+GABAergic+length,+branching+and+synaptogenesis.">Astrocyte secreted proteins selectively increase hippocampal GABAergic length, branching and synaptogenesis.</a> Moll. Cell. Neurosci. 43, 136-145 (2010).</li></ol>

Il test sinapsi di cui sopra si basa nel contesto dei nostri obiettivi sperimentali, in cui ci si concentra in gran parte su proiezioni eccitatori di RGCs, sia in purificati cultura o nella sezione del cervello. Abbiamo fornito una tabella che elenca gli anticorpi di riferimento che funzionano bene per l&#39;etichettatura sinapsi eccitatorie (Tabella 1). Questo test sinapsi può essere adattata a quantificare il numero delle sinapsi neuronali di ogni popolazione o di qualsiasi altro sottotip...

<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> Antigene </td><td> Specie </td><td> Monoclonali / policlonali </td><td> Venditore </td><td> Numero di catalogo </td><td> Diluizione </td><td> Lavori in Cultura </td><td> Opere nelle sezioni </td></tr><tr><td rowspan="10"> Presinaptico </td><td> Sinapsina </td><td> Coniglio </td><td> Policlonali </td><td> Sistemi di Synaptic </td><td> 106004 </td><td> 1:750 </td><td> Y </td><td> ND </td></tr><tr><td> Sinapsina </td><td> Mouse </td><td> Monoclonali </td><td> Sistemi di Synaptic </td><td> 106001 </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr><tr><td> Fagotto </td><td> Mouse </td><td> Monoclonali </td><td> Assay Designs </td><td> VAM-PS003F </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr><tr><td> Fagotto </td><td> Cavia </td><td> Policlonali </td><td> Sistemi di Synaptic </td><td> 141004 </td><td> 1:1000 </td><td> Y </td><td> ND </td></tr><tr><td> Synaptotagmin 1 </td><td> Coniglio </td><td> Policlonali </td><td> Sistemi di Synaptic </td><td> 105002 </td><td> 1:750 </td><td> Y </td><td> N </td></tr><tr><td> Synaptobrevin 2 (C1.69.1) </td><td> Mouse </td><td> Monoclonali </td><td> Sistemi di Synaptic </td><td> 104211 </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr><tr><td> Sinaptofisina (C1.7.2) </td><td> Mouse </td><td> Monoclonali </td><td> Sistemi di Synaptic </td><td> 101011 </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr><tr><td> VGlut1 </td><td> Mouse </td><td> Monoclonali </td><td> Millipore </td><td> MAB5502 </td><td> 1:2500 </td><td> N </td><td> Y </td></tr><tr><td> VGlut1 </td><td> Cavia </td><td> Policlonali </td><td> Millipore </td><td> AB5905 </td><td> 1:2500 </td><td> N </td><td> Y </td></tr><tr><td> VGlut2 </td><td> Cavia </td><td> Policlonali </td><td> Millipore </td><td> AB2251 </td><td> 1:2500 </td><td> N </td><td> Y </td></tr><tr><td rowspan="6"> Postsinaptico </td><td> PSD-95 (6G6-1C9 clone) </td><td> Mouse </td><td> Monoclonali </td><td> Affinità Bio Reagenti </td><td> MA1-045 </td><td> 1:750 </td><td> Y </td><td> N </td></tr><tr><td> PSD-95 </td><td> Coniglio </td><td> Policlonali </td><td> Zymed </td><td> 51-6900 </td><td> 1:500 </td><td> N </td><td> Y </td></tr><tr><td> Omero </td><td> Mouse </td><td> Monoclonali </td><td> Sistemi di Synaptic </td><td> 160011 </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> ND </td></tr><tr><td> Omero </td><td> Ratto </td><td> Policlonali </td><td> Millipore </td><td> AB5875 </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr><tr><td> Gephyrin </td><td> Coniglio </td><td> Policlonali </td><td> Sistemi di Synaptic </td><td> 147003 </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr><tr><td> Gephyrin </td><td> Mouse </td><td> Monoclonali </td><td> Sistemi di Synaptic </td><td> 147 </td><td> 1:200 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr></tbody></table> Tabella 1: Esempi di liste di buoni marcatori pre e post-sinaptici che abbiamo utilizzato con successo nel nostro test sinapsi. Essere consapevoli che questo non è un elenco esaustivo di tutti i marcatori disponibili. Y = Si, N = No, ND = non determinato. <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> Azienda </td><td> Gatto. No. </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 20012-027 </td></tr><tr><td> poli-d-lisina </td><td> Sigma </td><td> P6407 </td></tr><tr><td> Laminina </td><td> Cultrex </td><td> 3400-010-01 </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Roche Diagnostics GmbH </td><td> 9002-93-1 </td></tr><tr><td> Siero di capra normale </td><td> Gibco </td><td> 16210 </td></tr><tr><td> Vectashield con DAPI </td><td> Laboratori Vector </td><td> H-1200 </td></tr><tr><td> Ottobre </td><td> Tissue-Tek </td><td> 4583 </td></tr><tr><td> Tris-base (50 mm) </td><td> Pescatore </td><td> BP152-5 </td></tr><tr><td> Albumina di siero bovino </td><td> Sigma </td><td> A2153 </td></tr><tr><td> L-lisina </td><td> Sigma </td><td> L-1137 </td></tr><tr><td> 16% PFA soluzione </td><td> Electron Microscopy Sciences </td><td> 15711 </td></tr><tr><td> Granulare PFA </td><td> Electron Microscopy Sciences </td><td> 19210 </td></tr><tr><td> 24-ben cultura piastra </td><td> Falco </td><td> 35-3047 </td></tr><tr><td> Capra anti-topo anticorpi coniugati Alexa </td><td> Invitrogen </td><td> --- </td></tr><tr><td> Fornitura </td><td> Azienda </td><td> Gatto. No. </td></tr><tr><td> 12mm, n. 0 vetro coprioggetto </td><td> Karl Hecht Gmbh </td><td> 1105209 </td></tr><tr><td> No. 1,5 vetro coprioggetto (per le sezioni) </td><td> VWR Scientific </td><td> 48393241 </td></tr><tr><td> Vetrini </td><td> VWR Scientific </td><td> 48311-703 </td></tr></tbody></table>

quantifying synapses: an immunocytochemistry-based assay to quantify synapse number

Uno degli obiettivi più importanti nel campo delle neuroscienze è quello di capire i segnali molecolari che istruire prime fasi della formazione di sinapsi. Come tale, è diventato imperativo per sviluppare approcci obiettivo di quantificare i cambiamenti nella connettività sinaptica. A partire dalla fissazione del campione, il presente protocollo come quantificare il numero delle sinapsi sia dissociato cultura neuronale e nelle sezioni cerebrali con immunocitochimica. Utilizzando vano anticorpi specifici, abbiamo etichetta terminali presinaptici così come i luoghi di specializzazione post-sinaptici. Si definiscono sinapsi come punti di colocalizzazione tra i segnali generati da questi marcatori. Il numero di questi colocalizations è quantificati tramite un plug-in puncta Analyzer (scritto da Bary Wark, disponibile su richiesta, c.eroglu cellbio.duke.edu @) sotto la piattaforma software di analisi ImageJ. Il dosaggio sinapsi descritte in questo protocollo può essere applicato a qualsiasi preparazione del tessuto neurale o della cultura per cui si è selettivo marcatori pre-e post-sinaptici. Questo test sinapsi è uno strumento prezioso che può essere ampiamente utilizzato nello studio dello sviluppo sinaptico.

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Quantifying Synapses: an Immunocytochemistry-based Assay to Quantify Synapse Number

Questo protocollo dettagli come quantificare il numero delle sinapsi sia dissociato cultura neuronale e nelle sezioni cerebrali con immunocitochimica. Utilizzando vano anticorpi specifici, abbiamo etichetta terminali presinaptici così come i luoghi di specializzazione post-sinaptici. Si definiscono sinapsi come punti di colocalizzazione tra i segnali generati da questi marcatori.

Sinapsi quantificare: un Immunocitochimica basato su analisi per quantificare Numero Synapse

One of the most important goals in neuroscience is to understand the molecular cues that instruct early stages of synapse formation. As such it has become ...

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