Name: quantifying synapses: an immunocytochemistry-based assay to quantify synapse number
Uploaded: 2010-11-16T17:30:00
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ベンA.バレス（スタンフォード大学）の研究室で：涙点アナライザプラグインは、イメージのためにJはバリーウォーク（Physionコンサルティング現在のアドレス）によって書かれました。 資金調達; <ul><li>アルフレッドP.スローン財団</li><li>エスターA.とジョセフKlingensteinファンド投資法人</li><li>広範な生物医学研究財団</li><li>ハンチントン病のイニシアティブのために治す</li></ul>

準備するソリューション： <ol><li>抗体のバッファ： <ul><li> 150mMのNaCl </li><li> 50mMトリス - 塩基（フィッシャー、カタログ番号：BP152 - 5、50mMの） - 1.21グラム</li><li> 1％BSA（Sigma、カタログ番号：A2153、1％） - 2.0グラム</li><li> 100mMのL -リジン（Sigma、カタログ番号：L - 1137、100mMの） - 3.65グラム</li><li> 7.4にpHを調整する</li><li> 0.04％アジ化</li><li>蒸留H 2 Oで200mlにボリュームを調整</...

<ol>
	<li>Barres, B. A., Silverstein, B. E., Corey, D. P., Chun, L. L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological,+morphological,+and+electrophysiological+variation+among+retinal+ganglion+cells+purified+by+panning.">Immunological, morphological, and electrophysiological variation among retinal ganglion cells purified by panning.</a> Neuron. 1, 791-803 (1988).</li><li>Meyer-Franke, A., Kaplan, M. R., Pfrieger, F. W., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+signaling+interactions+that+promote+the+survival+and+growth+of+developing+retinal+ganglion+cells+in+culture.">Characterization of the signaling interactions that promote the survival and growth of developing retinal ganglion cells in culture.</a> Neuron. 15, 805-819 (1995).</li><li>Eroglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gabapentin+receptor+alpha2delta-1+is+a+neuronal+thrombospondin+receptor+responsible+for+excitatory+CNS+synaptogenesis.">Gabapentin receptor alpha2delta-1 is a neuronal thrombospondin receptor responsible for excitatory CNS synaptogenesis.</a> Cell. 139, 380-392 (2009).</li><li>Pfrieger, F. W., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+efficacy+enhanced+by+glial+cells+in+vitro.">Synaptic efficacy enhanced by glial cells in vitro.</a> Science. 277, 1684-1687 .</li><li>Ullian, E. M., Sapperstein, S. K., Christopherson, K. S., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+synapse+number+by+glia.">Control of synapse number by glia.</a> Science. 291, 657-661 (2001).</li><li>Christopherson, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombospondins+are+astrocyte-secreted+proteins+that+promote+CNS+synaptogenesis.">Thrombospondins are astrocyte-secreted proteins that promote CNS synaptogenesis.</a> Cell. 120, 421-433 (2005).</li><li>Godement, P., Salaun, J., Imbert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prenatal+and+postnatal+development+of+retinocollicular+projections+in+the+mouse.">Prenatal and postnatal development of retinocollicular projections in the mouse.</a> J. Comp. Neurol. 230, 552-575 (1985).</li><li>Schmidt, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+retinotopic+connections:+selective+stabilization+by+an+activity-dependent+mechanism.">Formation of retinotopic connections: selective stabilization by an activity-dependent mechanism.</a> Cell. Mol. Neurobiol. 5, 65-84 (1985).</li><li>Sachs, G. M., Jacobson, M., Caviness, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+changes+in+arborization+patterns+of+murine+retinocollicular+axons.">Postnatal changes in arborization patterns of murine retinocollicular axons.</a> J. Comp. Neurol. 246, 395-408 (1986).</li><li>Elmariah, S. B., Oh, E. J., Hughes, E. G., Balice-Gordon, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+regulate+inhibitory+synapse+formation+via+Trk-mediated+modulation+of+postsynaptic+GABAA+receptors.">Astrocytes regulate inhibitory synapse formation via Trk-mediated modulation of postsynaptic GABAA receptors.</a> J. Neurosci. 25, 3638-3650 (2005).</li><li>Hughes, E. G., Elmariah, S. B., Balice-Gordon, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+secreted+proteins+selectively+increase+hippocampal+GABAergic+length,+branching+and+synaptogenesis.">Astrocyte secreted proteins selectively increase hippocampal GABAergic length, branching and synaptogenesis.</a> Moll. Cell. Neurosci. 43, 136-145 (2010).</li></ol>

上記のシナプスのアッセイは、我々の実験の目標、ここで我々は文化を精製や脳のセクションのいずれかで、大きくRGCsの興奮性の予測に焦点を当てるのコンテキストに基づいています。私たちは、興奮性シナプスを（表1）のラベルにうまく参照テーブルのリストの抗体を提供している。 このシナプスのアッセイは、任意の神経集団または選択的なプリと後シナプスマー...

<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> 抗原 </td><td> 種 </td><td> ポリクローナル/モノクローナル </td><td> ベンダ </td><td> カタログ番号 </td><td> 希釈 </td><td> 文化の作品 </td><td> セクションの作品 </td></tr><tr><td rowspan="10">シナプス前の</td><td>シナプシン</td><td>ウサギ</td><td>ポリクローナル</td><td>シナプスシステム</td><td> 106004 </td><td> 1:750 </td><td> Y </td><td> ND </td></tr><tr><td>シナプシン</td><td>マウス</td><td>モノクローナル</td><td>シナプスシステム</td><td> 106001 </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr><tr><td>ファゴット</td><td>マウス</td><td>モノクローナル</td><td>アッセイデザイン</td><td> VAM - PS003F </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr><tr><td>ファゴット</td><td>モルモット</td><td>ポリクローナル</td><td>シナプスシステム</td><td> 141004 </td><td> 1:1000 </td><td> Y </td><td> ND </td></tr><tr><td>シナプトタグミン1 </td><td>ウサギ</td><td>ポリクローナル</td><td>シナプスシステム</td><td> 105002 </td><td> 1:750 </td><td> Y </td><td> N </td></tr><tr><td>シナプトブレビン2 （C1.69.1） </td><td>マウス</td><td>モノクローナル</td><td>シナプスシステム</td><td> 104211 </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr><tr><td>シナプトフィジン （C1.7.2） </td><td>マウス</td><td>モノクローナル</td><td>シナプスシステム</td><td> 101011 </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr><tr><td> VGlut1 </td><td>マウス</td><td>モノクローナル</td><td>ミリポア</td><td> MAB5502 </td><td> 1:2500 </td><td> N </td><td> Y </td></tr><tr><td> VGlut1 </td><td>モルモット</td><td>ポリクローナル</td><td>ミリポア</td><td> AB5905 </td><td> 1:2500 </td><td> N </td><td> Y </td></tr><tr><td> VGlut2 </td><td>モルモット</td><td>ポリクローナル</td><td>ミリポア</td><td> AB2251 </td><td> 1:2500 </td><td> N </td><td> Y </td></tr><tr><td rowspan="6">シナプス後の</td><td> PSD - 95 （6G6 - 1C9クローン） </td><td>マウス</td><td>モノクローナル</td><td>親和性バイオ試薬</td><td> MA1 - 045 </td><td> 1:750 </td><td> Y </td><td> N </td></tr><tr><td> PSD - 95 </td><td>ウサギ</td><td>ポリクローナル</td><td> ZYMED </td><td> 51から6900 </td><td> 1:500 </td><td> N </td><td> Y </td></tr><tr><td>ホーマー</td><td>マウス</td><td>モノクローナル</td><td>シナプスシステム</td><td> 160011 </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> ND </td></tr><tr><td>ホーマー</td><td>ラット</td><td>ポリクローナル</td><td>ミリポア</td><td> AB5875 </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr><tr><td> Gephyrin </td><td>ウサギ</td><td>ポリクローナル</td><td>シナプスシステム</td><td> 147003 </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr><tr><td> Gephyrin </td><td>マウス</td><td>モノクローナル</td><td>シナプスシステム</td><td> 147 </td><td> 1:200 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr></tbody></table> 表1：我々は成功私たちのシナプスのアッセイで使用されていることを良いプリとシナプス後のマーカーのリストの例。これはすべての利用可能なマーカーの網羅的なリストではないことに注意してください。 Y =はい、N =いいえ、ND =データなし。 <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 試薬 </td><td> 会社 </td><td> ネコ。いいえ </td></tr><tr><td> PBS </td><td>インビトロジェン</td><td> 20012-027 </td></tr><tr><td>ポリ- D -リジン</td><td>シグマ</td><td> P6407 </td></tr><tr><td>ラミニン</td><td> Cultrex </td><td> 3400-010-01 </td></tr><tr><td>トリトンX - 100 </td><td>ロシュダイアグノスティック徳国</td><td> 9002-93-1 </td></tr><tr><td>正常ヤギ血清</td><td>ギブコ</td><td> 16210 </td></tr><tr><td> DAPIとVectaShield </td><td>ベクターラボラトリーズ</td><td> H - 1200 </td></tr><tr><td> OCT </td><td>組織 - Tek社</td><td> 4583 </td></tr><tr><td>トリス-ベース（50 mM）を</td><td>フィッシャー</td><td> BP152 - 5 </td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>シグマ</td><td> A2153 </td></tr><tr><td> L -リジン</td><td>シグマ</td><td> L - 1137 </td></tr><tr><td> 16パーセントPFAのソリューション</td><td>電子顕微鏡学</td><td> 15711 </td></tr><tr><td>粒状のPFA </td><td>電子顕微鏡学</td><td> 19210 </td></tr><tr><td> 24ウェル培養プレート</td><td>ファルコン</td><td> 35から3047 </td></tr><tr><td>ヤギ抗マウスアレクサ標識抗体</td><td>インビトロジェン</td><td> --- </td></tr><tr><td> サプライ </td><td> 会社 </td><td> ネコ。いいえ </td></tr><tr><td> 12mmの0号ガラスのカバースリップ</td><td>カールヘクト徳国</td><td> 1105209 </td></tr><tr><td>第1.5ガラスカバースリップ（スライス用） </td><td> VWRサイエンティフィック</td><td> 48393241 </td></tr><tr><td>スライドガラス</td><td> VWRサイエンティフィック</td><td> 48311-703 </td></tr></tbody></table>

quantifying synapses: an immunocytochemistry-based assay to quantify synapse number

神経科学における最も重要な目標の1つは、シナプス形成の初期段階を指示する分子の合図を理解することです。このように、それはシナプス接続の変化を定量化するための客観的なアプローチを開発するために必要不可欠になっています。サンプルの固定から始まる、このプロトコルの詳細については、どのように解離神経細胞培養中および免疫細胞化学を用いて脳切片の両方シナプス数を定量化する。コンパートメント特異的抗体を用いて、我々は、シナプス前終末だけでなく、シナプス後部の専門のサイトにラベルを付けます。我々は、これらのマーカーによって生成された信号間の共局在のポイントとしてシナプスを定義します。これらcolocalizationsの数は、ImageJの解析ソフトウェアのプラットフォームの下涙点アナライザ（リクエストも承りますバリーウォーク、、c.eroglu @ cellbio.duke.eduによって書かれた）プラグインを使用して定量される。このプロトコルで説明されているシナプスのアッセイは、選択前と後シナプスマーカーを持っている任意の神経組織や文化を準備するために適用することができます。このシナプスのアッセイは、広くシナプス開発の研究に利用することができる貴重なツールです。

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Quantifying Synapses: an Immunocytochemistry-based Assay to Quantify Synapse Number

このプロトコルは、解離神経培養および免疫細胞化学を用いて脳切片の両方シナプス数を定量化する方法を詳しく説明します。コンパートメント特異的抗体を用いて、我々は、シナプス前終末だけでなく、シナプス後部の専門のサイトにラベルを付けます。我々は、これらのマーカーによって生成された信号間の共局在のポイントとしてシナプスを定義します。

定量シナプス：シナプス数を定量する免疫細胞ベースのアッセイ

One of the most important goals in neuroscience is to understand the molecular cues that instruct early stages of synapse formation. As such it has become ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

神経コロニー形成細胞アッセイ：神経前駆細胞から善意の神経幹細胞を区別するアッセイ

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

An Engulfment Assay: A Protocol to Assess Interactions Between CNS Phagocytes and Neurons

貪食アッセイ：CNS食細胞と神経細胞間の相互作用を評価するためのプロトコル

Phagocytosis is a process in which a cell engulfs material (entire cell, parts of a cell, debris, etc.) in its surrounding extracellular environment and ...

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

網膜リボンシナプスにおける膜受容体の高分解能定量的イムノゴールド分析

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

の記録細胞内の電圧応答のための電気生理学的手法<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;光刺激に感光体と介在ニューロン<em&gt;インビボ</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila

Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila

に神経変性を定量化するために、マス組織学<em&gt;ショウジョウバエ</em

Progressive neurodegenerative diseases like Alzheimer&#39;s disease (AD) or Parkinson&#39;s disease (PD) are an increasing threat to human health ...

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

海馬の齧歯動物の脳スライスにおけるシナプス密度の評価

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...

Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

Sod1 突然変異体蛋白質集計における細胞の高いコンテンツ定量化のための分析法の開発

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc ...

Visualization of Thalamocortical Axon Branching and Synapse Formation in Organotypic Cocultures

視床皮質軸索分岐とシナプスの可視化脊髄共培養系における形成

Axon branching and synapse formation are crucial processes for establishing precise neuronal circuits. During development, sensory thalamocortical (TC) ...

An Improved Method for Collection of Cerebrospinal Fluid from Anesthetized Mice

麻酔下のマウスから脳脊髄液のコレクションのための改良法

The cerebrospinal fluid (CSF) is a valuable body fluid for analysis in neuroscience research. It is one of the fluids in closest contact with the central ...

Purification of the Dendritic Filopodia-rich Fraction

樹状フィロポディアリッチ画の精製

Dendritic filopodia are thin and long protrusions based on the actin filament, and they extend and retract as if searching for a target axon. When the ...