Name: quantifying synapses: an immunocytochemistry-based assay to quantify synapse number
Uploaded: 2010-11-16T17:30:00
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Puncta 분석기 플러그인 J는 배리 워크 (현재 주소 : Physion 컨설팅)에 의해 작성되었습니다 이미지를위한 벤 A. Barres의 연구실에서 (스탠포드 대학). 기금; <ul><li> 알프레드 P. 슬로언 재단 </li><li> 에스더 A. 요셉 Klingenstein 펀드, 주식 회사 </li><li> 광범위한 바이오 메디컬 연구 재단 </li><li> 헌팅턴의 질병 이니셔티브에 대한 치료 </li></ul>

준비하는 솔루션 : <ol><li> 항체 버퍼 : <ul><li> 150 MM NaCl </li><li> 50 MM - 트리스베이스 (피셔, 고양이 번호 :. BP152 - 5, 50 ㎜) - 1.21 g </li><li> 1퍼센트 BSA (시그마, 고양이 번호 :. A2153, 1 %) - 2.0 g </li><li> 100 MM L - 라이신 (시그마, 고양이 번호 :. L - 1137, 100 ㎜) - 3.65 g </li><li> 7.4으로 산도를 조정 </li><li> 0.04 %의 Azide </li><li> 소주 H 2 O. 200 ML에 볼륨을 조정 </li><li> 0.22μm 필터를 통해 필터 (Millipore, ...

<ol>
	<li>Barres, B. A., Silverstein, B. E., Corey, D. P., Chun, L. L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological,+morphological,+and+electrophysiological+variation+among+retinal+ganglion+cells+purified+by+panning.">Immunological, morphological, and electrophysiological variation among retinal ganglion cells purified by panning.</a> Neuron. 1, 791-803 (1988).</li><li>Meyer-Franke, A., Kaplan, M. R., Pfrieger, F. W., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+signaling+interactions+that+promote+the+survival+and+growth+of+developing+retinal+ganglion+cells+in+culture.">Characterization of the signaling interactions that promote the survival and growth of developing retinal ganglion cells in culture.</a> Neuron. 15, 805-819 (1995).</li><li>Eroglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gabapentin+receptor+alpha2delta-1+is+a+neuronal+thrombospondin+receptor+responsible+for+excitatory+CNS+synaptogenesis.">Gabapentin receptor alpha2delta-1 is a neuronal thrombospondin receptor responsible for excitatory CNS synaptogenesis.</a> Cell. 139, 380-392 (2009).</li><li>Pfrieger, F. W., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+efficacy+enhanced+by+glial+cells+in+vitro.">Synaptic efficacy enhanced by glial cells in vitro.</a> Science. 277, 1684-1687 .</li><li>Ullian, E. M., Sapperstein, S. K., Christopherson, K. S., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+synapse+number+by+glia.">Control of synapse number by glia.</a> Science. 291, 657-661 (2001).</li><li>Christopherson, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombospondins+are+astrocyte-secreted+proteins+that+promote+CNS+synaptogenesis.">Thrombospondins are astrocyte-secreted proteins that promote CNS synaptogenesis.</a> Cell. 120, 421-433 (2005).</li><li>Godement, P., Salaun, J., Imbert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prenatal+and+postnatal+development+of+retinocollicular+projections+in+the+mouse.">Prenatal and postnatal development of retinocollicular projections in the mouse.</a> J. Comp. Neurol. 230, 552-575 (1985).</li><li>Schmidt, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+retinotopic+connections:+selective+stabilization+by+an+activity-dependent+mechanism.">Formation of retinotopic connections: selective stabilization by an activity-dependent mechanism.</a> Cell. Mol. Neurobiol. 5, 65-84 (1985).</li><li>Sachs, G. M., Jacobson, M., Caviness, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+changes+in+arborization+patterns+of+murine+retinocollicular+axons.">Postnatal changes in arborization patterns of murine retinocollicular axons.</a> J. Comp. Neurol. 246, 395-408 (1986).</li><li>Elmariah, S. B., Oh, E. J., Hughes, E. G., Balice-Gordon, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+regulate+inhibitory+synapse+formation+via+Trk-mediated+modulation+of+postsynaptic+GABAA+receptors.">Astrocytes regulate inhibitory synapse formation via Trk-mediated modulation of postsynaptic GABAA receptors.</a> J. Neurosci. 25, 3638-3650 (2005).</li><li>Hughes, E. G., Elmariah, S. B., Balice-Gordon, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+secreted+proteins+selectively+increase+hippocampal+GABAergic+length,+branching+and+synaptogenesis.">Astrocyte secreted proteins selectively increase hippocampal GABAergic length, branching and synaptogenesis.</a> Moll. Cell. Neurosci. 43, 136-145 (2010).</li></ol>

위에서 설명한 버렸네 분석은 하나의 문화를 정화 또는 뇌 섹션에서, 우리는 RGCs의 흥분성의 예측에 주로 초점을했었습니다 우리의 실험 목표의 컨텍스트를 기반으로합니다. 우리는 흥분성의 시냅스 (표 1) 라벨을 위해 잘 작동 참조 테이블 목록 항체를 제공하고 있습니다. 이 버렸네 분석은 버렸네의 모든 인구의 연결 번호 또는 선택 사전 및 postsynaptic 마커가있는 다른 신경...

<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> 항원 </td><td> 종 </td><td> Polyclonal / 단클론 </td><td> 공급 업체 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 노동 희석 </td><td> 문화 웍스 </td><td> 섹션 웍스 </td></tr><tr><td rowspan="10"> Presynaptic </td><td> Synapsin </td><td> 토끼 </td><td> Polyclonal </td><td> 시냅스 시스템 </td><td> 106004 </td><td> 1:750 </td><td> Y </td><td> ND </td></tr><tr><td> Synapsin </td><td> 마우스 </td><td> 단클론 </td><td> 시냅스 시스템 </td><td> 106001 </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr><tr><td> 바순 </td><td> 마우스 </td><td> 단클론 </td><td> 분석 설계 </td><td> VAM - PS003F </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr><tr><td> 바순 </td><td> 기니피그 </td><td> Polyclonal </td><td> 시냅스 시스템 </td><td> 141004 </td><td> 1:1000 </td><td> Y </td><td> ND </td></tr><tr><td> Synaptotagmin 1 </td><td> 토끼 </td><td> Polyclonal </td><td> 시냅스 시스템 </td><td> 105002 </td><td> 1:750 </td><td> Y </td><td> N </td></tr><tr><td> Synaptobrevin 2 (C1.69.1) </td><td> 마우스 </td><td> 단클론 </td><td> 시냅스 시스템 </td><td> 104211 </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr><tr><td> Synaptophysin (C1.7.2) </td><td> 마우스 </td><td> 단클론 </td><td> 시냅스 시스템 </td><td> 101011 </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr><tr><td> VGlut1 </td><td> 마우스 </td><td> 단클론 </td><td> Millipore </td><td> MAB5502 </td><td> 1:2500 </td><td> N </td><td> Y </td></tr><tr><td> VGlut1 </td><td> 기니피그 </td><td> Polyclonal </td><td> Millipore </td><td> AB5905 </td><td> 1:2500 </td><td> N </td><td> Y </td></tr><tr><td> VGlut2 </td><td> 기니피그 </td><td> Polyclonal </td><td> Millipore </td><td> AB2251 </td><td> 1:2500 </td><td> N </td><td> Y </td></tr><tr><td rowspan="6"> Postsynaptic </td><td> PSD - 95 (6G6 - 1C9 클론) </td><td> 마우스 </td><td> 단클론 </td><td> 친화 바이오 시약 </td><td> MA1 - 045 </td><td> 1:750 </td><td> Y </td><td> N </td></tr><tr><td> PSD - 95 </td><td> 토끼 </td><td> Polyclonal </td><td> Zymed </td><td> 51-6900 </td><td> 1:500 </td><td> N </td><td> Y </td></tr><tr><td> 호머 </td><td> 마우스 </td><td> 단클론 </td><td> 시냅스 시스템 </td><td> 160011 </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> ND </td></tr><tr><td> 호머 </td><td> 쥐 </td><td> Polyclonal </td><td> Millipore </td><td> AB5875 </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr><tr><td> Gephyrin </td><td> 토끼 </td><td> Polyclonal </td><td> 시냅스 시스템 </td><td> 147003 </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr><tr><td> Gephyrin </td><td> 마우스 </td><td> 단클론 </td><td> 시냅스 시스템 </td><td> 147 </td><td> 1:200 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr></tbody></table> 표 1 : 우리가 성공적으로 버렸네 분석에 이용한다는 좋은 사전과 postsynaptic 마커 목록 예제. 이 사용할 수있는 모든 마커의 완전한 목록을지지 않습니다. Y = 예, N = 아니오, ND = 결정되지 않습니다. <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 시약 </td><td> 회사 </td><td> 고양이. 번호 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 20012-027 </td></tr><tr><td> 폴리 - D - 라이신 </td><td> 시그마 </td><td> P6407 </td></tr><tr><td> Laminin </td><td> Cultrex </td><td> 3400-010-01 </td></tr><tr><td> 트리톤 X - 100 </td><td> 로체 진단 GMBH </td><td> 9002-93-1 </td></tr><tr><td> 정상 염소 혈청 </td><td> Gibco </td><td> 16,210 </td></tr><tr><td> DAPI로 VectaShield </td><td> 벡터 연구소 </td><td> H - 1200 </td></tr><tr><td> OCT </td><td> 조직 테크 </td><td> 4583 </td></tr><tr><td> 트리스 -베이스 (50 ㎜) </td><td> 어부 </td><td> BP152 - 5 </td></tr><tr><td> 소 혈청 알부민 </td><td> 시그마 </td><td> A2153 </td></tr><tr><td> 리터 - 라이신 </td><td> 시그마 </td><td> L - 1137 </td></tr><tr><td> 16% PFA 솔루션 </td><td> 전자 현미경 과학 </td><td> 15,711 </td></tr><tr><td> 입상 PFA </td><td> 전자 현미경 과학 </td><td> 19,210 </td></tr><tr><td> 24 잘 문화 플레이트 </td><td> 매 </td><td> 35-3047 </td></tr><tr><td> 염소 항 마우스 알렉사 복합 항체 </td><td> Invitrogen </td><td> --- </td></tr><tr><td> 공급 </td><td> 회사 </td><td> 고양이. 번호 </td></tr><tr><td> 12mm, 번호 0 유리 coverslips </td><td> 칼 헥트 GMBH </td><td> 1,105,209 </td></tr><tr><td> 번호 1.5 유리 coverslip (조각)을 </td><td> VWR 과학 </td><td> 48393241 </td></tr><tr><td> 유리 슬라이드 </td><td> VWR 과학 </td><td> 48311-703 </td></tr></tbody></table>

quantifying synapses: an immunocytochemistry-based assay to quantify synapse number

신경 과학의 가장 중요한 목표 중 하나는 버렸네 형성의 초기 단계를 지시 분자 신호를 이해하는 것입니다. 따라서 그것은 시냅스 연결에 변화를 수치 객관적 방법을 개발하기 위해 필수적이되었습니다. 샘플 고정부터,이 프로토콜의 세부 내용은 방법 dissociated의 연결을 문화와 immunocytochemistry를 사용하여 뇌 부분에서 모두 버렸네 번호를 수치. 구획 특정 항체를 사용하여, 우리는 presynaptic 터미널뿐만 아니라 postsynaptic 전문 사이트를 라벨. 우리는이 표시에 의해 생성되는 신호 사이에 colocalization 지점으로 시냅스를 정의합니다. 이 colocalizations의 수는 ImageJ 분석 소프트웨어 플랫폼에 따라 Puncta 분석기 (요청시 가능합니다 바리 워크, c.eroglu @ cellbio.duke.edu 작성한)에 플러그를 사용하여 계량입니다. 이 프로토콜에 설명되어 버렸네 분석은 선택적 사전 및 postsynaptic 마커를 가지고있는 신경 조직이나 문화를 준비 적용할 수 있습니다. 이 버렸네 분석이 널리 시냅스 개발 연구에 활용할 수있는 귀중한 도구입니다.

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Quantifying Synapses: an Immunocytochemistry-based Assay to Quantify Synapse Number

이 프로토콜은 dissociated의 연결을 문화와 immunocytochemistry를 사용하여 뇌 부분에서 모두 버렸네 번호를 계량하는 방법 세부 사항. 구획 특정 항체를 사용하여, 우리는 presynaptic 터미널뿐만 아니라 postsynaptic 전문 사이트를 라벨. 우리는이 표시에 의해 생성되는 신호 사이에 colocalization 지점으로 시냅스를 정의합니다.

Quantifying 시냅스 : 시냅스 번호를 수치 Immunocytochemistry 기반 어세이

One of the most important goals in neuroscience is to understand the molecular cues that instruct early stages of synapse formation. As such it has become ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

세포 어세를 형성 신경 콜로니 : 신경 전구 세포로부터 타고난 신경 줄기 세포를 차별 어세이

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

연구

신경과학

An Engulfment Assay: A Protocol to Assess Interactions Between CNS Phagocytes and Neurons

말림 분석 : CNS 식세포와 신경 세포 사이의 상호 작용을 평가하기위한 프로토콜

Phagocytosis is a process in which a cell engulfs material (entire cell, parts of a cell, debris, etc.) in its surrounding extracellular environment and ...

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

망막 리본 시냅스에서 막 수용체의 고해상도 양이 Immunogold 분석

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

의 기록 세포 내 전압 응답에 대한 전기 생리 방법<em&gt; 초파리</em&gt; 빛 자극에 광수와의 interneurons<em&gt; 생체</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila

Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila

질량 조직학은에 신경 퇴행을 정량화하기<em&gt; 초파리</em

Progressive neurodegenerative diseases like Alzheimer&#39;s disease (AD) or Parkinson&#39;s disease (PD) are an increasing threat to human health ...

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

시 냅 스 밀도 Hippocampal 설치류 두뇌 분할 영역에서의 평가

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...

Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

살아있는 세포에 Sod1 돌연변이 단백질 집계 형성의 높은 콘텐츠 정량화에 대 한 분석 결과 개발

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc ...

Visualization of Thalamocortical Axon Branching and Synapse Formation in Organotypic Cocultures

분기 Thalamocortical 축 삭과 시 냅 스의 시각화 Organotypic Cocultures에서 형성

Axon branching and synapse formation are crucial processes for establishing precise neuronal circuits. During development, sensory thalamocortical (TC) ...

An Improved Method for Collection of Cerebrospinal Fluid from Anesthetized Mice

마 취 쥐에서 척수의 컬렉션에 대 한 개선된 방법

The cerebrospinal fluid (CSF) is a valuable body fluid for analysis in neuroscience research. It is one of the fluids in closest contact with the central ...

Purification of the Dendritic Filopodia-rich Fraction

수지상 필로포디아 풍부한 분획의 정화

Dendritic filopodia are thin and long protrusions based on the actin filament, and they extend and retract as if searching for a target axon. When the ...