Name: quantifying synapses: an immunocytochemistry-based assay to quantify synapse number
Uploaded: 2010-11-16T17:30:00
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Puncta Analyzer Plug-in para o Image J foi escrito por Barry Wark (endereço atual: Consultoria Physion) no laboratório de Ben A. Barres (Stanford University). Financiamento; <ul><li> Alfred P. Sloan Foundation </li><li> O A. Esther e José Klingenstein Fund, Inc. </li><li> Fundação de Pesquisa Biomédica ampla </li><li> Cura para a Iniciativa de Huntington s Disease </li></ul>

Soluções de Preparo: <ol><li> Tampão de anticorpos: <ul><li> 150 mM NaCl </li><li> 50 mM Tris-Base (Fisher, Cat No:. BP152-5, 50 mM) - 1,21 g </li><li> 1% BSA (Sigma, Cat No:. A2153, 1%) - 2,0 g </li><li> 100 mM L-lisina (Sigma, Cat No:. L-1137, 100 mM) - 3,65 g </li><li> Ajustar o pH para 7,4 </li><li> Azida 0,04% </li><li> Ajustar o volume para 200 ml com água destilada H 2 O. </li><li> Filtrar através 0.22μm filtro (Millipore, Cat No:. SCGPU02RE). </li></ul></li><li> PFA diluente: <ul><l...

<ol>
	<li>Barres, B. A., Silverstein, B. E., Corey, D. P., Chun, L. L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological,+morphological,+and+electrophysiological+variation+among+retinal+ganglion+cells+purified+by+panning.">Immunological, morphological, and electrophysiological variation among retinal ganglion cells purified by panning.</a> Neuron. 1, 791-803 (1988).</li><li>Meyer-Franke, A., Kaplan, M. R., Pfrieger, F. W., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+signaling+interactions+that+promote+the+survival+and+growth+of+developing+retinal+ganglion+cells+in+culture.">Characterization of the signaling interactions that promote the survival and growth of developing retinal ganglion cells in culture.</a> Neuron. 15, 805-819 (1995).</li><li>Eroglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gabapentin+receptor+alpha2delta-1+is+a+neuronal+thrombospondin+receptor+responsible+for+excitatory+CNS+synaptogenesis.">Gabapentin receptor alpha2delta-1 is a neuronal thrombospondin receptor responsible for excitatory CNS synaptogenesis.</a> Cell. 139, 380-392 (2009).</li><li>Pfrieger, F. W., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+efficacy+enhanced+by+glial+cells+in+vitro.">Synaptic efficacy enhanced by glial cells in vitro.</a> Science. 277, 1684-1687 .</li><li>Ullian, E. M., Sapperstein, S. K., Christopherson, K. S., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+synapse+number+by+glia.">Control of synapse number by glia.</a> Science. 291, 657-661 (2001).</li><li>Christopherson, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombospondins+are+astrocyte-secreted+proteins+that+promote+CNS+synaptogenesis.">Thrombospondins are astrocyte-secreted proteins that promote CNS synaptogenesis.</a> Cell. 120, 421-433 (2005).</li><li>Godement, P., Salaun, J., Imbert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prenatal+and+postnatal+development+of+retinocollicular+projections+in+the+mouse.">Prenatal and postnatal development of retinocollicular projections in the mouse.</a> J. Comp. Neurol. 230, 552-575 (1985).</li><li>Schmidt, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+retinotopic+connections:+selective+stabilization+by+an+activity-dependent+mechanism.">Formation of retinotopic connections: selective stabilization by an activity-dependent mechanism.</a> Cell. Mol. Neurobiol. 5, 65-84 (1985).</li><li>Sachs, G. M., Jacobson, M., Caviness, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+changes+in+arborization+patterns+of+murine+retinocollicular+axons.">Postnatal changes in arborization patterns of murine retinocollicular axons.</a> J. Comp. Neurol. 246, 395-408 (1986).</li><li>Elmariah, S. B., Oh, E. J., Hughes, E. G., Balice-Gordon, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+regulate+inhibitory+synapse+formation+via+Trk-mediated+modulation+of+postsynaptic+GABAA+receptors.">Astrocytes regulate inhibitory synapse formation via Trk-mediated modulation of postsynaptic GABAA receptors.</a> J. Neurosci. 25, 3638-3650 (2005).</li><li>Hughes, E. G., Elmariah, S. B., Balice-Gordon, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+secreted+proteins+selectively+increase+hippocampal+GABAergic+length,+branching+and+synaptogenesis.">Astrocyte secreted proteins selectively increase hippocampal GABAergic length, branching and synaptogenesis.</a> Moll. Cell. Neurosci. 43, 136-145 (2010).</li></ol>

O ensaio sinapse descrito acima é baseado no contexto de nossos objetivos experimental, no qual nos concentramos principalmente em projeções excitatórias do RGCs, seja na cultura ou purificada na seção cérebro. Nós fornecemos uma referência anticorpos tabela listando que funcionam bem para rotulagem sinapses excitatórias (Tabela 1). Este ensaio sinapse pode ser adaptado para a quantificação do número sinapse de uma população neuronal ou qualquer outro subtipo sináptico para o...

<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> Antígeno </td><td> Espécies </td><td> Monoclonais / policlonais </td><td> Vendedor </td><td> Número de catálogo </td><td> Diluição </td><td> Trabalha em Cultura </td><td> Obras nas Seções </td></tr><tr><td rowspan="10"> Pré-sináptica </td><td> Sinapsina </td><td> Coelho </td><td> Policlonal </td><td> Sistemas Synaptic </td><td> 106004 </td><td> 1:750 </td><td> Y </td><td> ND </td></tr><tr><td> Sinapsina </td><td> Mouse </td><td> Monoclonal </td><td> Sistemas Synaptic </td><td> 106001 </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr><tr><td> Fagote </td><td> Mouse </td><td> Monoclonal </td><td> Designs ensaio </td><td> VAM-PS003F </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr><tr><td> Fagote </td><td> Cobaia </td><td> Policlonal </td><td> Sistemas Synaptic </td><td> 141004 </td><td> 1:1000 </td><td> Y </td><td> ND </td></tr><tr><td> Sinaptotagmina 1 </td><td> Coelho </td><td> Policlonal </td><td> Sistemas Synaptic </td><td> 105002 </td><td> 1:750 </td><td> Y </td><td> N </td></tr><tr><td> Sinaptobrevina 2 (C1.69.1) </td><td> Mouse </td><td> Monoclonal </td><td> Sistemas Synaptic </td><td> 104211 </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr><tr><td> Sinaptofisina (C1.7.2) </td><td> Mouse </td><td> Monoclonal </td><td> Sistemas Synaptic </td><td> 101011 </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr><tr><td> VGlut1 </td><td> Mouse </td><td> Monoclonal </td><td> Millipore </td><td> MAB5502 </td><td> 1:2500 </td><td> N </td><td> Y </td></tr><tr><td> VGlut1 </td><td> Cobaia </td><td> Policlonal </td><td> Millipore </td><td> AB5905 </td><td> 1:2500 </td><td> N </td><td> Y </td></tr><tr><td> VGlut2 </td><td> Cobaia </td><td> Policlonal </td><td> Millipore </td><td> AB2251 </td><td> 1:2500 </td><td> N </td><td> Y </td></tr><tr><td rowspan="6"> Pós-sinápticos </td><td> PSD-95 (6G6 1C9-clone) </td><td> Mouse </td><td> Monoclonal </td><td> Afinidade Bio Reagentes </td><td> MA1-045 </td><td> 1:750 </td><td> Y </td><td> N </td></tr><tr><td> PSD-95 </td><td> Coelho </td><td> Policlonal </td><td> Zymed </td><td> 51-6900 </td><td> 1:500 </td><td> N </td><td> Y </td></tr><tr><td> Pombo-correio </td><td> Mouse </td><td> Monoclonal </td><td> Sistemas Synaptic </td><td> 160011 </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> ND </td></tr><tr><td> Pombo-correio </td><td> Rato </td><td> Policlonal </td><td> Millipore </td><td> AB5875 </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr><tr><td> Gephyrin </td><td> Coelho </td><td> Policlonal </td><td> Sistemas Synaptic </td><td> 147003 </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr><tr><td> Gephyrin </td><td> Mouse </td><td> Monoclonal </td><td> Sistemas Synaptic </td><td> 147 </td><td> 1:200 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr></tbody></table> Tabela 1: Lista de exemplos de bons marcadores pré-e pós-sinápticos que temos utilizado com sucesso em nosso ensaio sinapse. Estar ciente de que esta não é uma lista exaustiva de todos os marcadores disponíveis. Y = Sim, N = Não, ND = não determinado. <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> Companhia </td><td> Gato. Não. </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 20012-027 </td></tr><tr><td> poli-d-lisina </td><td> Sigma </td><td> P6407 </td></tr><tr><td> Laminina </td><td> Cultrex </td><td> 3400-010-01 </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Roche Diagnostics Gmbh </td><td> 9002-93-1 </td></tr><tr><td> Soro normal de cabra </td><td> Gibco </td><td> 16210 </td></tr><tr><td> VectaShield com DAPI </td><td> Vector Laboratories </td><td> H-1200 </td></tr><tr><td> Outubro </td><td> Tissue-Tek </td><td> 4583 </td></tr><tr><td> Tris-Base (50 mM) </td><td> Pescador </td><td> BP152-5 </td></tr><tr><td> Albumina de soro bovino </td><td> Sigma </td><td> A2153 </td></tr><tr><td> l-lisina </td><td> Sigma </td><td> L-1137 </td></tr><tr><td> 16% de solução PFA </td><td> Microscopia Eletrônica de Ciências </td><td> 15711 </td></tr><tr><td> PFA granular </td><td> Microscopia Eletrônica de Ciências </td><td> 19210 </td></tr><tr><td> 24 poços placa de cultura </td><td> Falcão </td><td> 35-3047 </td></tr><tr><td> Anticorpos de cabra anti-camundongo conjugado Alexa </td><td> Invitrogen </td><td> --- </td></tr><tr><td> Fornecimento </td><td> Companhia </td><td> Gato. Não. </td></tr><tr><td> 12mm, n º 0 lamínulas de vidro </td><td> Karl Hecht Gmbh </td><td> 1105209 </td></tr><tr><td> No. 1,5 vidro lamela (para fatias) </td><td> VWR Scientific </td><td> 48393241 </td></tr><tr><td> Lâminas de vidro </td><td> VWR Scientific </td><td> 48311-703 </td></tr></tbody></table>

quantifying synapses: an immunocytochemistry-based assay to quantify synapse number

Um dos objetivos mais importantes da neurociência é entender os sinais moleculares que instruem estágios iniciais da formação de sinapses. Como tal, tornou-se imperativo para desenvolver abordagens objetivo de quantificar alterações na conectividade sináptica. A partir de fixação da amostra, este protocolo detalhes como quantificar o número sinapse neuronal tanto na cultura dissociada e nas seções do cérebro utilizando imunocitoquímica. Usando compartimento de anticorpos específicos, nós rótulo terminais pré-sinápticos, bem como sites de especialização pós-sináptica. Nós definimos sinapses como pontos de co-localização entre os sinais gerados por estes marcadores. O número dessas colocalizations é quantificado através de um plug in puncta Analyzer (escrito por Bary Wark, disponível mediante solicitação, c.eroglu cellbio.duke.edu @), sob a plataforma de software de análise de ImageJ. O ensaio sinapse descritos neste protocolo pode ser aplicado a qualquer preparação de tecidos e cultura neural para o qual você tem seletiva marcadores pré-e pós-sináptica. Este ensaio sinapse é uma ferramenta valiosa que pode ser amplamente utilizada no estudo do desenvolvimento sináptica.

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Quantifying Synapses: an Immunocytochemistry-based Assay to Quantify Synapse Number

Este protocolo detalhes como quantificar o número sinapse neuronal tanto na cultura dissociada e nas seções do cérebro utilizando imunocitoquímica. Usando compartimento de anticorpos específicos, nós rótulo terminais pré-sinápticos, bem como sites de especialização pós-sináptica. Nós definimos sinapses como pontos de co-localização entre os sinais gerados por estes marcadores.

Sinapses quantificar: um ensaio baseado em Imunocitoquímica para a quantificação do número Synapse

One of the most important goals in neuroscience is to understand the molecular cues that instruct early stages of synapse formation. As such it has become ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

Neurais Colony-Forming Assay Cell: um ensaio para Discriminar Bona Fide células-tronco neurais de células progenitoras neurais

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

Neurociência

An Assay for Permeability of the Zebrafish Embryonic Neuroepithelium

Um ensaio para a permeabilidade do neuroepitélio Zebrafish Embryonic

The brain ventricular system is conserved among vertebrates and is composed of a series of interconnected cavities called brain ventricles, which form ...

An Engulfment Assay: A Protocol to Assess Interactions Between CNS Phagocytes and Neurons

Uma imersão Ensaio: Um protocolo para avaliar Interações entre CNS fagócitos e Neurônios

Phagocytosis is a process in which a cell engulfs material (entire cell, parts of a cell, debris, etc.) in its surrounding extracellular environment and ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

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Método eletrofisiológico para respostas gravação intracelular de tensão<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorreceptores e Interneurônios à luz Estímulos<em&gt; In Vivo</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

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Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

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Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

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