Name: quantifying synapses: an immunocytochemistry-based assay to quantify synapse number
Uploaded: 2010-11-16T17:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Synapses: an Immunocytochemistry-based Assay to Quantify Synapse Number at JoVE.com

Анализатор Puncta Плагин для изображения J была написана Барри Уорк (текущий адрес: Physion Consulting) в лаборатории А. Бен Баррес (Стэнфордский университет). Финансирования; <ul><li> Альфреда П. Слоуна </li><li> Эстер А. и Иосиф Klingenstein фонд, Inc </li><li> Широкий биомедицинских исследовательского фонда </li><li> Лекарство от болезни Хантингтона с инициативой </li></ul>

Решения по подготовке: <ol><li> Антитела буфера: <ul><li> 150 мМ NaCl </li><li> 50 мМ Трис-Base (Fisher, Cat No:. BP152-5, 50 мм) - 1,21 г </li><li> 1% BSA (Sigma, Cat No:. A2153, 1%) - 2,0 г </li><li> 100 мМ L-лизина (Sigma, Cat No:. L-1137, 100 мм) - 3,65 г </li><li> Отрегулируйте рН до 7,4 </li><li> 0,04% азида </li><li> Регулировка громкости в 200 мл дистиллированной H 2 O. </l...

<ol>
	<li>Barres, B. A., Silverstein, B. E., Corey, D. P., Chun, L. L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological,+morphological,+and+electrophysiological+variation+among+retinal+ganglion+cells+purified+by+panning.">Immunological, morphological, and electrophysiological variation among retinal ganglion cells purified by panning.</a> Neuron. 1, 791-803 (1988).</li><li>Meyer-Franke, A., Kaplan, M. R., Pfrieger, F. W., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+signaling+interactions+that+promote+the+survival+and+growth+of+developing+retinal+ganglion+cells+in+culture.">Characterization of the signaling interactions that promote the survival and growth of developing retinal ganglion cells in culture.</a> Neuron. 15, 805-819 (1995).</li><li>Eroglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gabapentin+receptor+alpha2delta-1+is+a+neuronal+thrombospondin+receptor+responsible+for+excitatory+CNS+synaptogenesis.">Gabapentin receptor alpha2delta-1 is a neuronal thrombospondin receptor responsible for excitatory CNS synaptogenesis.</a> Cell. 139, 380-392 (2009).</li><li>Pfrieger, F. W., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+efficacy+enhanced+by+glial+cells+in+vitro.">Synaptic efficacy enhanced by glial cells in vitro.</a> Science. 277, 1684-1687 .</li><li>Ullian, E. M., Sapperstein, S. K., Christopherson, K. S., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+synapse+number+by+glia.">Control of synapse number by glia.</a> Science. 291, 657-661 (2001).</li><li>Christopherson, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombospondins+are+astrocyte-secreted+proteins+that+promote+CNS+synaptogenesis.">Thrombospondins are astrocyte-secreted proteins that promote CNS synaptogenesis.</a> Cell. 120, 421-433 (2005).</li><li>Godement, P., Salaun, J., Imbert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prenatal+and+postnatal+development+of+retinocollicular+projections+in+the+mouse.">Prenatal and postnatal development of retinocollicular projections in the mouse.</a> J. Comp. Neurol. 230, 552-575 (1985).</li><li>Schmidt, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+retinotopic+connections:+selective+stabilization+by+an+activity-dependent+mechanism.">Formation of retinotopic connections: selective stabilization by an activity-dependent mechanism.</a> Cell. Mol. Neurobiol. 5, 65-84 (1985).</li><li>Sachs, G. M., Jacobson, M., Caviness, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+changes+in+arborization+patterns+of+murine+retinocollicular+axons.">Postnatal changes in arborization patterns of murine retinocollicular axons.</a> J. Comp. Neurol. 246, 395-408 (1986).</li><li>Elmariah, S. B., Oh, E. J., Hughes, E. G., Balice-Gordon, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+regulate+inhibitory+synapse+formation+via+Trk-mediated+modulation+of+postsynaptic+GABAA+receptors.">Astrocytes regulate inhibitory synapse formation via Trk-mediated modulation of postsynaptic GABAA receptors.</a> J. Neurosci. 25, 3638-3650 (2005).</li><li>Hughes, E. G., Elmariah, S. B., Balice-Gordon, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+secreted+proteins+selectively+increase+hippocampal+GABAergic+length,+branching+and+synaptogenesis.">Astrocyte secreted proteins selectively increase hippocampal GABAergic length, branching and synaptogenesis.</a> Moll. Cell. Neurosci. 43, 136-145 (2010).</li></ol>

Синапс анализа, описанного выше, основана в контексте наших экспериментальных целей, в которых мы ориентируемся в основном на возбуждающие проекции РГК, либо в очищенной культуры или в мозге разделе. Мы предоставили ссылку таблица с перечнем антитела, которые хорошо работают для марки...

<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> Антиген </td><td> Вид </td><td> Моноклональные / Поликлональные </td><td> Продавец </td><td> Номер в каталоге </td><td> Разбавление </td><td> Работы в области культуры </td><td> Работает в разделах </td></tr><tr><td rowspan="10"> Пресинаптического </td><td> Synapsin </td><td> Кролик </td><td> Поликлональные </td><td> Synaptic системы </td><td> 106004 </td><td> 1:750 </td><td> У </td><td> Н. Д. </td></tr><tr><td> Synapsin </td><td> Мышь </td><td> Моноклональный </td><td> Synaptic системы </td><td> 106001 </td><td> 1:500 </td><td> У </td><td> У </td></tr><tr><td> Фагот </td><td> Мышь </td><td> Моноклональный </td><td> Анализ образцов </td><td> VAM-PS003F </td><td> 1:500 </td><td> У </td><td> У </td></tr><tr><td> Фагот </td><td> Морская свинка </td><td> Поликлональные </td><td> Synaptic системы </td><td> 141004 </td><td> 1:1000 </td><td> У </td><td> Н. Д. </td></tr><tr><td> Synaptotagmin 1 </td><td> Кролик </td><td> Поликлональные </td><td> Synaptic системы </td><td> 105002 </td><td> 1:750 </td><td> У </td><td> N </td></tr><tr><td> Synaptobrevin 2 (C1.69.1) </td><td> Мышь </td><td> Моноклональный </td><td> Synaptic системы </td><td> 104211 </td><td> 1:500 </td><td> У </td><td> У </td></tr><tr><td> Synaptophysin (C1.7.2) </td><td> Мышь </td><td> Моноклональный </td><td> Synaptic системы </td><td> 101011 </td><td> 1:500 </td><td> У </td><td> У </td></tr><tr><td> VGlut1 </td><td> Мышь </td><td> Моноклональный </td><td> Millipore </td><td> MAB5502 </td><td> 1:2500 </td><td> N </td><td> У </td></tr><tr><td> VGlut1 </td><td> Морская свинка </td><td> Поликлональные </td><td> Millipore </td><td> AB5905 </td><td> 1:2500 </td><td> N </td><td> У </td></tr><tr><td> VGlut2 </td><td> Морская свинка </td><td> Поликлональные </td><td> Millipore </td><td> AB2251 </td><td> 1:2500 </td><td> N </td><td> У </td></tr><tr><td rowspan="6"> Постсинаптические </td><td> PSD-95 (6G6-1C9 клон) </td><td> Мышь </td><td> Моноклональный </td><td> Affinity Био Реагенты </td><td> MA1-045 </td><td> 1:750 </td><td> У </td><td> N </td></tr><tr><td> PSD-95 </td><td> Кролик </td><td> Поликлональные </td><td> Zymed </td><td> 51-6900 </td><td> 1:500 </td><td> N </td><td> У </td></tr><tr><td> Почтовый голубь </td><td> Мышь </td><td> Моноклональный </td><td> Synaptic системы </td><td> 160011 </td><td> 1:500 </td><td> У </td><td> Н. Д. </td></tr><tr><td> Почтовый голубь </td><td> Крыса </td><td> Поликлональные </td><td> Millipore </td><td> AB5875 </td><td> 1:500 </td><td> У </td><td> У </td></tr><tr><td> Gephyrin </td><td> Кролик </td><td> Поликлональные </td><td> Synaptic системы </td><td> 147003 </td><td> 1:500 </td><td> У </td><td> У </td></tr><tr><td> Gephyrin </td><td> Мышь </td><td> Моноклональный </td><td> Synaptic системы </td><td> 147 </td><td> 1:200 </td><td> У </td><td> У </td></tr></tbody></table> Таблица 1: Список примеров хорошей пре-и постсинаптического маркеры, которые мы успешно использовали в нашей синапса анализа. Имейте в виду, что это не исчерпывающий список всех доступных маркеров. Y = Да, N = Нет, ND = не определена. <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Реагент </td><td> Компания </td><td> Кат. Нет. </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 20012-027 </td></tr><tr><td> поли-D-лизина </td><td> Сигма </td><td> P6407 </td></tr><tr><td> Ламинин </td><td> Cultrex </td><td> 3400-010-01 </td></tr><tr><td> Тритон Х-100 </td><td> Roche Diagnostics Gmbh </td><td> 9002-93-1 </td></tr><tr><td> Нормальная сыворотки козьего </td><td> Гибко </td><td> 16210 </td></tr><tr><td> VectaShield с DAPI </td><td> Vector Laboratories </td><td> H-1200 </td></tr><tr><td> Октябрь </td><td> Ткань-Tek </td><td> 4583 </td></tr><tr><td> Трис-Base (50 мМ) </td><td> Рыболов </td><td> BP152-5 </td></tr><tr><td> Бычьего сывороточного альбумина </td><td> Сигма </td><td> A2153 </td></tr><tr><td> L-лизина </td><td> Сигма </td><td> L-1137 </td></tr><tr><td> 16% PFA решение </td><td> Электронная микроскопия наук </td><td> 15711 </td></tr><tr><td> Гранулированный PFA </td><td> Электронная микроскопия наук </td><td> 19210 </td></tr><tr><td> 24-луночных культуры пластины </td><td> Сокол </td><td> 35-3047 </td></tr><tr><td> Антимышиного Alexa конъюгированных антител </td><td> Invitrogen </td><td> --- </td></tr><tr><td> Снабжение </td><td> Компания </td><td> Кат. Нет. </td></tr><tr><td> 12мм, № 0 стекла покровные </td><td> Карл Гехт Gmbh </td><td> 1105209 </td></tr><tr><td> № 1.5 покровное стекло (для срезов) </td><td> VWR Научные </td><td> 48393241 </td></tr><tr><td> Стекло слайдов </td><td> VWR Научные </td><td> 48311-703 </td></tr></tbody></table>

quantifying synapses: an immunocytochemistry-based assay to quantify synapse number

Одним из наиболее важных целей в области неврологии, чтобы понять молекулярные сигналы, которые поручить ранних этапах формирование синапса. Как таковое оно стало необходимым разработать объективные подходы к количественной оценки изменений в синаптических соединений. Начиная от образца фиксации, этот протокол содержит подробные сведения по количественному синапса числа как в диссоциированных нейронов культуры и в мозгу разделы, используя иммуноцитохимия. Использование купе-специфические антитела, мы обозначаем пресинаптических терминалах, а также участки постсинаптических специализации. Мы определяем синапсов как точки колокализации между сигналы, генерируемые этими маркерами. Число этих colocalizations является количественно, используя подключение Puncta Analyzer (написаны Бари Уорк, предоставляются по запросу, c.eroglu @ cellbio.duke.edu) в рамках программной платформы анализа ImageJ. Синапс анализа, описанного в этом протоколе могут быть применены к любой нейронной подготовки ткани или культуры, для которых селективное пре-и постсинаптического маркеров. Этот анализ синапса является ценным инструментом, который может быть широко использован в изучении синаптических развития.

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Synapses: an Immunocytochemistry-based Assay to Quantify Synapse Number at JoVE.com

Quantifying Synapses: an Immunocytochemistry-based Assay to Quantify Synapse Number

Этот протокол содержит подробные сведения по количественному синапса числа как в диссоциированных нейронов культуры и в мозгу разделы, используя иммуноцитохимия. Использование купе-специфические антитела, мы обозначаем пресинаптических терминалах, а также участки постсинаптических специализации. Мы определяем синапсов как точки колокализации между сигналы, генерируемые этими маркерами.

Количественная Синапсы: Иммуноцитохимическая основе Пробирной количественно Synapse Количество

One of the most important goals in neuroscience is to understand the molecular cues that instruct early stages of synapse formation. As such it has become ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

Neural-колония Формирование анализа клеточной: Пробирной различать Добросовестный нервные стволовые клетки из нервных клеток-предшественников

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

An Engulfment Assay: A Protocol to Assess Interactions Between CNS Phagocytes and Neurons

Охвате Анализ: Протокол для оценки взаимодействия между ЦНС фагоцитов и нейронов

Phagocytosis is a process in which a cell engulfs material (entire cell, parts of a cell, debris, etc.) in its surrounding extracellular environment and ...

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

Высокое разрешение Количественный Immunogold Анализ мембранными рецепторами на сетчатки синапсах ленточного

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Электрофизиологические Способ записи ответов внутриклеточный амперных<em&gt; Drosophila</em&gt; Фоторецепторов и Интернейроны к световой раздражитель<em&gt; В Vivo</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila

Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila

Масса гистологии к Количественно нейродегенерации<em&gt; Drosophila</em

Progressive neurodegenerative diseases like Alzheimer&#39;s disease (AD) or Parkinson&#39;s disease (PD) are an increasing threat to human health ...

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

Оценка плотности синапсов в срезах гиппокампа грызунов мозга

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...

Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

Развитие анализа высокое содержание количественной оценки совокупных формирования Sod1 Мутантный белок в живых клетках

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc ...

Visualization of Thalamocortical Axon Branching and Synapse Formation in Organotypic Cocultures

Визуализация Thalamocortical аксона ветвления и синапса формирования в Organotypic Cocultures

Axon branching and synapse formation are crucial processes for establishing precise neuronal circuits. During development, sensory thalamocortical (TC) ...

An Improved Method for Collection of Cerebrospinal Fluid from Anesthetized Mice

Усовершенствованный метод для коллекции спинномозговой жидкости от наркотизированных мышей

The cerebrospinal fluid (CSF) is a valuable body fluid for analysis in neuroscience research. It is one of the fluids in closest contact with the central ...

Purification of the Dendritic Filopodia-rich Fraction

Очистка дендритной филоподии богатой фракцией

Dendritic filopodia are thin and long protrusions based on the actin filament, and they extend and retract as if searching for a target axon. When the ...