Name: quantifying synapses: an immunocytochemistry-based assay to quantify synapse number
Uploaded: 2010-11-16T17:30:00
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En el laboratorio de Ben A. Barres (Stanford University).: Puntos lagrimales Plug-in para la imagen J fue escrito por Barry Wark (Consultoría Physion dirección actual) Analizador Financiación; <ul><li> Alfred P. Sloan Foundation </li><li> El A. Esther y José Klingenstein Fund Inc., </li><li> Fundación Broad Investigación Biomédica </li><li> Cura para la Iniciativa de la Enfermedad de Huntington s </li></ul>

Soluciones para preparar: <ol><li> Anticuerpos Buffer: <ul><li> 150 mM NaCl </li><li> 50 mM Tris-Base (Fisher, Cat No:. BP152-5, 50 mM) - 1,21 g </li><li> 1% de BSA (Sigma, Cat No:. A2153, 1%) - 2,0 g </li><li> 100 mM de L-lisina (Sigma, Cat No:. L-1137, 100 mM) - 3,65 g </li><li> Ajustar el pH a 7.4 </li><li> 0,04% de azida </li><li> Ajuste el volumen a 200 ml con agua destilada H 2 O. </li><li> Filtrar a través de 0.22μm de filtro (Millipore, Cat No:. SCGPU02RE). </li></ul></li><li> PFA diluy...

<ol>
	<li>Barres, B. A., Silverstein, B. E., Corey, D. P., Chun, L. L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological,+morphological,+and+electrophysiological+variation+among+retinal+ganglion+cells+purified+by+panning.">Immunological, morphological, and electrophysiological variation among retinal ganglion cells purified by panning.</a> Neuron. 1, 791-803 (1988).</li><li>Meyer-Franke, A., Kaplan, M. R., Pfrieger, F. W., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+signaling+interactions+that+promote+the+survival+and+growth+of+developing+retinal+ganglion+cells+in+culture.">Characterization of the signaling interactions that promote the survival and growth of developing retinal ganglion cells in culture.</a> Neuron. 15, 805-819 (1995).</li><li>Eroglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gabapentin+receptor+alpha2delta-1+is+a+neuronal+thrombospondin+receptor+responsible+for+excitatory+CNS+synaptogenesis.">Gabapentin receptor alpha2delta-1 is a neuronal thrombospondin receptor responsible for excitatory CNS synaptogenesis.</a> Cell. 139, 380-392 (2009).</li><li>Pfrieger, F. W., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+efficacy+enhanced+by+glial+cells+in+vitro.">Synaptic efficacy enhanced by glial cells in vitro.</a> Science. 277, 1684-1687 .</li><li>Ullian, E. M., Sapperstein, S. K., Christopherson, K. S., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+synapse+number+by+glia.">Control of synapse number by glia.</a> Science. 291, 657-661 (2001).</li><li>Christopherson, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombospondins+are+astrocyte-secreted+proteins+that+promote+CNS+synaptogenesis.">Thrombospondins are astrocyte-secreted proteins that promote CNS synaptogenesis.</a> Cell. 120, 421-433 (2005).</li><li>Godement, P., Salaun, J., Imbert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prenatal+and+postnatal+development+of+retinocollicular+projections+in+the+mouse.">Prenatal and postnatal development of retinocollicular projections in the mouse.</a> J. Comp. Neurol. 230, 552-575 (1985).</li><li>Schmidt, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+retinotopic+connections:+selective+stabilization+by+an+activity-dependent+mechanism.">Formation of retinotopic connections: selective stabilization by an activity-dependent mechanism.</a> Cell. Mol. Neurobiol. 5, 65-84 (1985).</li><li>Sachs, G. M., Jacobson, M., Caviness, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+changes+in+arborization+patterns+of+murine+retinocollicular+axons.">Postnatal changes in arborization patterns of murine retinocollicular axons.</a> J. Comp. Neurol. 246, 395-408 (1986).</li><li>Elmariah, S. B., Oh, E. J., Hughes, E. G., Balice-Gordon, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+regulate+inhibitory+synapse+formation+via+Trk-mediated+modulation+of+postsynaptic+GABAA+receptors.">Astrocytes regulate inhibitory synapse formation via Trk-mediated modulation of postsynaptic GABAA receptors.</a> J. Neurosci. 25, 3638-3650 (2005).</li><li>Hughes, E. G., Elmariah, S. B., Balice-Gordon, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+secreted+proteins+selectively+increase+hippocampal+GABAergic+length,+branching+and+synaptogenesis.">Astrocyte secreted proteins selectively increase hippocampal GABAergic length, branching and synaptogenesis.</a> Moll. Cell. Neurosci. 43, 136-145 (2010).</li></ol>

El ensayo de sinapsis se ha descrito anteriormente se basa en el contexto de nuestros objetivos experimentales, en el que nos centramos principalmente en las proyecciones de excitación de la CGR, ya sea en la cultura purificada o en la sección del cerebro. Hemos proporcionado un listado de anticuerpos tabla de referencia que funcionan bien para el etiquetado de las sinapsis excitadoras (Tabla 1). Este ensayo sinapsis pueden ser adaptados para cuantificar el número de sinapsis de una pobla...

<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> Antígeno </td><td> Especies </td><td> Monoclonal / policlonales </td><td> Vendedor </td><td> Número de catálogo </td><td> Dilución </td><td> Obras en Cultura </td><td> Obras en las secciones </td></tr><tr><td rowspan="10"> Presináptica </td><td> Sinapsina </td><td> Conejo </td><td> Policlonal </td><td> Sistemas de Synaptic </td><td> 106004 </td><td> 1:750 </td><td> Y </td><td> ND </td></tr><tr><td> Sinapsina </td><td> Ratón </td><td> Monoclonales </td><td> Sistemas de Synaptic </td><td> 106001 </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr><tr><td> Fagot </td><td> Ratón </td><td> Monoclonales </td><td> Diseño del ensayo </td><td> VAM-PS003F </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr><tr><td> Fagot </td><td> Conejillo de Indias </td><td> Policlonal </td><td> Sistemas de Synaptic </td><td> 141004 </td><td> 1:1000 </td><td> Y </td><td> ND </td></tr><tr><td> Sinaptotagmina 1 </td><td> Conejo </td><td> Policlonal </td><td> Sistemas de Synaptic </td><td> 105002 </td><td> 1:750 </td><td> Y </td><td> N </td></tr><tr><td> Sinaptobrevina 2 (C1.69.1) </td><td> Ratón </td><td> Monoclonales </td><td> Sistemas de Synaptic </td><td> 104211 </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr><tr><td> Sinaptofisina (C1.7.2) </td><td> Ratón </td><td> Monoclonales </td><td> Sistemas de Synaptic </td><td> 101011 </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr><tr><td> VGlut1 </td><td> Ratón </td><td> Monoclonales </td><td> Millipore </td><td> MAB5502 </td><td> 1:2500 </td><td> N </td><td> Y </td></tr><tr><td> VGlut1 </td><td> Conejillo de Indias </td><td> Policlonal </td><td> Millipore </td><td> AB5905 </td><td> 1:2500 </td><td> N </td><td> Y </td></tr><tr><td> VGlut2 </td><td> Conejillo de Indias </td><td> Policlonal </td><td> Millipore </td><td> AB2251 </td><td> 1:2500 </td><td> N </td><td> Y </td></tr><tr><td rowspan="6"> Postsinápticos </td><td> PSD-95 (6G6-1C9 clon) </td><td> Ratón </td><td> Monoclonales </td><td> Afinidad Bio Reactivos </td><td> MA1-045 </td><td> 1:750 </td><td> Y </td><td> N </td></tr><tr><td> PSD-95 </td><td> Conejo </td><td> Policlonal </td><td> Zymed </td><td> 51-6900 </td><td> 1:500 </td><td> N </td><td> Y </td></tr><tr><td> Homer </td><td> Ratón </td><td> Monoclonales </td><td> Sistemas de Synaptic </td><td> 160011 </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> ND </td></tr><tr><td> Homer </td><td> Rata </td><td> Policlonal </td><td> Millipore </td><td> AB5875 </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr><tr><td> Gephyrin </td><td> Conejo </td><td> Policlonal </td><td> Sistemas de Synaptic </td><td> 147003 </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr><tr><td> Gephyrin </td><td> Ratón </td><td> Monoclonales </td><td> Sistemas de Synaptic </td><td> 147 </td><td> 1:200 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr></tbody></table> Tabla 1: lista de ejemplos de buenos marcadores pre-y post-sinápticas que se han utilizado con éxito en nuestro ensayo sinapsis. Tenga en cuenta que esto no es una lista exhaustiva de todas las marcas disponibles. Y = Sí, N = No, ND = no determinado. <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Reactivo </td><td> Empresa </td><td> Gato. No. </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 20012-027 </td></tr><tr><td> poli-D-lisina </td><td> Sigma </td><td> P6407 </td></tr><tr><td> Laminina </td><td> Cultrex </td><td> 3400-010-01 </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Roche Diagnostics GmbH </td><td> 9002-93-1 </td></tr><tr><td> Suero normal de cabra </td><td> Gibco </td><td> 16210 </td></tr><tr><td> Vectashield con DAPI </td><td> Vector Laboratories </td><td> H-1200 </td></tr><tr><td> Octubre </td><td> Tissue-Tek </td><td> 4583 </td></tr><tr><td> Tris-base (50 mM) </td><td> Pescador </td><td> BP152-5 </td></tr><tr><td> Albúmina de suero bovino </td><td> Sigma </td><td> A2153 </td></tr><tr><td> l-lisina </td><td> Sigma </td><td> L-1137 </td></tr><tr><td> 16% PFA solución </td><td> Microscopía electrónica de Ciencias </td><td> 15711 </td></tr><tr><td> Granular PFA </td><td> Microscopía electrónica de Ciencias </td><td> 19210 </td></tr><tr><td> De 24 pocillos placa </td><td> Halcón </td><td> 35-3047 </td></tr><tr><td> Cabra anti-ratón conjugado con anticuerpos Alexa </td><td> Invitrogen </td><td> --- </td></tr><tr><td> Suministro </td><td> Empresa </td><td> Gato. No. </td></tr><tr><td> 12 mm, n º 0 de vidrio cubreobjetos </td><td> Karl Hecht Gmbh </td><td> 1105209 </td></tr><tr><td> No. 1.5 cubreobjetos de vidrio (para cortes) </td><td> VWR Ciencia </td><td> 48393241 </td></tr><tr><td> Portaobjetos de vidrio </td><td> VWR Ciencia </td><td> 48311-703 </td></tr></tbody></table>

quantifying synapses: an immunocytochemistry-based assay to quantify synapse number

Uno de los objetivos más importantes de la neurociencia es comprender las señales moleculares que dan instrucciones a las primeras etapas de la formación de sinapsis. Como tal, se ha convertido en imprescindible para desarrollar métodos objetivos para cuantificar los cambios en la conectividad sináptica. A partir de la fijación de la muestra, este protocolo detalles de cómo cuantificar el número de sinapsis en cultivos neuronales disociadas y en las secciones del cerebro utilizando inmunocitoquímica. Utilizando anticuerpos específicos contra el compartimiento, que etiqueta los terminales presinápticos, así como los sitios de especialización post-sináptica. Se define como puntos de sinapsis de colocalización entre las señales generadas por estos marcadores. El número de estos colocalizations se cuantifica mediante un enchufe en el Analizador de puntos lagrimales (escrito por Bary Wark, disponibles bajo petición, c.eroglu cellbio.duke.edu @) en la plataforma de software ImageJ análisis. El ensayo de sinapsis se describe en este protocolo se puede aplicar a cualquier tejido neural preparación o la cultura para los que tiene marcadores selectivos de pre-y post-sinápticas. Este ensayo sinapsis es una herramienta valiosa que puede ser ampliamente utilizada en el estudio del desarrollo sináptico.

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Quantifying Synapses: an Immunocytochemistry-based Assay to Quantify Synapse Number

Este protocolo detalla la forma de cuantificar el número de sinapsis en cultivos neuronales disociadas y en las secciones del cerebro utilizando inmunocitoquímica. Utilizando anticuerpos específicos contra el compartimiento, que etiqueta los terminales presinápticos, así como los sitios de especialización post-sináptica. Se define como puntos de sinapsis de colocalización entre las señales generadas por estos marcadores.

Las sinapsis cuantificar: un ensayo basado en inmunocitoquímica para cuantificar número de sinapsis

One of the most important goals in neuroscience is to understand the molecular cues that instruct early stages of synapse formation. As such it has become ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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Neural formadoras de colonias ensayo de células: un ensayo para discriminar Bona Fide células troncales nerviosas de células progenitoras neurales

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

Investigación

Neurociencias

An Assay for Permeability of the Zebrafish Embryonic Neuroepithelium

Un ensayo para la permeabilidad del neuroepitelio embrionario de pez cebra

The brain ventricular system is conserved among vertebrates and is composed of a series of interconnected cavities called brain ventricles, which form ...

An Engulfment Assay: A Protocol to Assess Interactions Between CNS Phagocytes and Neurons

Un ensayo de Inmersión en: Un Protocolo para Evaluar Interacciones entre CNS fagocitos y neuronas

Phagocytosis is a process in which a cell engulfs material (entire cell, parts of a cell, debris, etc.) in its surrounding extracellular environment and ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

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Método electrofisiológico para registrar las respuestas de voltaje intracelular<em&gt; Drosophila</em&gt; Los fotorreceptores y interneuronas a la luz Estímulos<em&gt; En Vivo</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila

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La histología de masas para cuantificar la neurodegeneración en<em&gt; Drosophila</em

Progressive neurodegenerative diseases like Alzheimer&#39;s disease (AD) or Parkinson&#39;s disease (PD) are an increasing threat to human health ...

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

Evaluación de la densidad de sinapsis en rebanadas de hipocampo cerebral de roedor

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Un método mejorado para la recolección de líquido cefalorraquídeo de los ratones anestesiados

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Investigaciones electrofisiológicas de la función de sinapsis de retinogeniculato y corticogeniculato

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