Name: quantifying synapses: an immunocytochemistry-based assay to quantify synapse number
Uploaded: 2010-11-16T17:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Synapses: an Immunocytochemistry-based Assay to Quantify Synapse Number at JoVE.com

Puncta Analyzer Plug-in Ben A. Barres laboratuar J Barry Wark (Güncel adresi: Physion Danışmanlık) tarafından yazılmıştı (Stanford Üniversitesi). Finansman; <ul><li> Alfred P. Sloan Vakfı </li><li> Esther A. ve Joseph Klingenstein Fonu, Inc. </li><li> Geniş Biyomedikal Araştırma Vakfı </li><li> Cure Huntington Hastalığı Girişimi </li></ul>

Hazırlık için Çözümler: <ol><li> Antikor Tampon: <ul><li> 150 mM NaCl </li><li> 50 mM Tris-Bankası (Fisher, Kedi No: BP152-5, 50 mM) - 1.21 g </li><li> % 1 BSA (Sigma, Kedi: A2153,% 1) - 2.0 g </li><li> 100 mM L-lisin (Sigma, Kedi No: L-1137, 100 mM) - 3.65 g </li><li> PH 7.4 &#39;e ayarlayın </li><li> % 0.04 Azid </li><li> 200 ml distile H 2 O. ile ses seviyesini ayarlayın . </li><li> (Millipore, Kedi No: SCGPU02RE) 0.22μm filtre süzülür. </li></ul></li><li> PFA Diluant: <ul><li> 16...

<ol>
	<li>Barres, B. A., Silverstein, B. E., Corey, D. P., Chun, L. L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological,+morphological,+and+electrophysiological+variation+among+retinal+ganglion+cells+purified+by+panning.">Immunological, morphological, and electrophysiological variation among retinal ganglion cells purified by panning.</a> Neuron. 1, 791-803 (1988).</li><li>Meyer-Franke, A., Kaplan, M. R., Pfrieger, F. W., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+signaling+interactions+that+promote+the+survival+and+growth+of+developing+retinal+ganglion+cells+in+culture.">Characterization of the signaling interactions that promote the survival and growth of developing retinal ganglion cells in culture.</a> Neuron. 15, 805-819 (1995).</li><li>Eroglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gabapentin+receptor+alpha2delta-1+is+a+neuronal+thrombospondin+receptor+responsible+for+excitatory+CNS+synaptogenesis.">Gabapentin receptor alpha2delta-1 is a neuronal thrombospondin receptor responsible for excitatory CNS synaptogenesis.</a> Cell. 139, 380-392 (2009).</li><li>Pfrieger, F. W., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+efficacy+enhanced+by+glial+cells+in+vitro.">Synaptic efficacy enhanced by glial cells in vitro.</a> Science. 277, 1684-1687 .</li><li>Ullian, E. M., Sapperstein, S. K., Christopherson, K. S., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+synapse+number+by+glia.">Control of synapse number by glia.</a> Science. 291, 657-661 (2001).</li><li>Christopherson, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombospondins+are+astrocyte-secreted+proteins+that+promote+CNS+synaptogenesis.">Thrombospondins are astrocyte-secreted proteins that promote CNS synaptogenesis.</a> Cell. 120, 421-433 (2005).</li><li>Godement, P., Salaun, J., Imbert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prenatal+and+postnatal+development+of+retinocollicular+projections+in+the+mouse.">Prenatal and postnatal development of retinocollicular projections in the mouse.</a> J. Comp. Neurol. 230, 552-575 (1985).</li><li>Schmidt, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+retinotopic+connections:+selective+stabilization+by+an+activity-dependent+mechanism.">Formation of retinotopic connections: selective stabilization by an activity-dependent mechanism.</a> Cell. Mol. Neurobiol. 5, 65-84 (1985).</li><li>Sachs, G. M., Jacobson, M., Caviness, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+changes+in+arborization+patterns+of+murine+retinocollicular+axons.">Postnatal changes in arborization patterns of murine retinocollicular axons.</a> J. Comp. Neurol. 246, 395-408 (1986).</li><li>Elmariah, S. B., Oh, E. J., Hughes, E. G., Balice-Gordon, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+regulate+inhibitory+synapse+formation+via+Trk-mediated+modulation+of+postsynaptic+GABAA+receptors.">Astrocytes regulate inhibitory synapse formation via Trk-mediated modulation of postsynaptic GABAA receptors.</a> J. Neurosci. 25, 3638-3650 (2005).</li><li>Hughes, E. G., Elmariah, S. B., Balice-Gordon, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+secreted+proteins+selectively+increase+hippocampal+GABAergic+length,+branching+and+synaptogenesis.">Astrocyte secreted proteins selectively increase hippocampal GABAergic length, branching and synaptogenesis.</a> Moll. Cell. Neurosci. 43, 136-145 (2010).</li></ol>

RGCs eksitatör projeksiyonlar büyük ölçüde odak neyin deneysel hedefleri bağlamında kültür arıtılmış veya beyin bölümünde, yukarıda açıklanan sinaps tahlil ya dayanır. Biz eksitatör sinapslar (Tablo 1) etiketleme için iyi bir referans masayı antikorları sağladı. Bu sinaps tahlil, sinaps herhangi bir nöronal nüfusun sayısı ya da seçici bir pre-ve postsinaptik işaretleyici olduğu başka herhangi bir sinaptik alt tipi ölçmek için adapte edilebilir. Örneğin...

<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> Antijen </td><td> Tür </td><td> Poliklonal / monoklonal </td><td> Satıcı </td><td> Katalog Numarası </td><td> Seyreltme </td><td> Kültür çalışır. </td><td> İşleri Kısım </td></tr><tr><td rowspan="10"> Presinaptik </td><td> Synapsin </td><td> Tavşan </td><td> Poliklonal </td><td> Synaptic Sistemleri </td><td> 106004 </td><td> 1:750 </td><td> Y </td><td> ND </td></tr><tr><td> Synapsin </td><td> Fare </td><td> Monoklonal </td><td> Synaptic Sistemleri </td><td> 106001 </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr><tr><td> Fagot </td><td> Fare </td><td> Monoklonal </td><td> Testi Tasarımlar </td><td> VAM-PS003F </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr><tr><td> Fagot </td><td> Guinea Pig </td><td> Poliklonal </td><td> Synaptic Sistemleri </td><td> 141004 </td><td> 1:1000 </td><td> Y </td><td> ND </td></tr><tr><td> Synaptotagmin 1 </td><td> Tavşan </td><td> Poliklonal </td><td> Synaptic Sistemleri </td><td> 105002 </td><td> 1:750 </td><td> Y </td><td> N </td></tr><tr><td> Synaptobrevin 2 (C1.69.1) </td><td> Fare </td><td> Monoklonal </td><td> Synaptic Sistemleri </td><td> 104211 </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr><tr><td> Sinaptofizin (C1.7.2) </td><td> Fare </td><td> Monoklonal </td><td> Synaptic Sistemleri </td><td> 101011 </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr><tr><td> VGlut1 </td><td> Fare </td><td> Monoklonal </td><td> Millipore </td><td> MAB5502 </td><td> 1:2500 </td><td> N </td><td> Y </td></tr><tr><td> VGlut1 </td><td> Kobay </td><td> Poliklonal </td><td> Millipore </td><td> AB5905 </td><td> 1:2500 </td><td> N </td><td> Y </td></tr><tr><td> VGlut2 </td><td> Kobay </td><td> Poliklonal </td><td> Millipore </td><td> AB2251 </td><td> 1:2500 </td><td> N </td><td> Y </td></tr><tr><td rowspan="6"> Postsinaptik </td><td> PSD-95 (6G6-1C9 klon) </td><td> Fare </td><td> Monoklonal </td><td> Affinity Bio Reaktifleri </td><td> MA1-045 </td><td> 1:750 </td><td> Y </td><td> N </td></tr><tr><td> PSD-95 </td><td> Tavşan </td><td> Poliklonal </td><td> Zymed </td><td> 51-6900 </td><td> 1:500 </td><td> N </td><td> Y </td></tr><tr><td> Beysbolde tur vuruşu </td><td> Fare </td><td> Monoklonal </td><td> Synaptic Sistemleri </td><td> 160011 </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> ND </td></tr><tr><td> Beysbolde tur vuruşu </td><td> Sıçan </td><td> Poliklonal </td><td> Millipore </td><td> AB5875 </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr><tr><td> Gephyrin </td><td> Tavşan </td><td> Poliklonal </td><td> Synaptic Sistemleri </td><td> 147003 </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr><tr><td> Gephyrin </td><td> Fare </td><td> Monoklonal </td><td> Synaptic Sistemleri </td><td> 147 </td><td> 1:200 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr></tbody></table> Tablo 1: biz bizim sinaps tayininde başarılı bir şekilde kullanılmaktadır olduğunu iyi pre-ve postsinaptik belirteçlerin Listeler örnekler. Bu mevcut tüm belirteçlerin bir liste olmadığını farkında olun. Y = Evet, N = Hayır, ND = Tespit Edilemeyen. <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Reaktif </td><td> Şirket </td><td> Cat. Hayır. </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 20012-027 </td></tr><tr><td> poli-d-lisin </td><td> Sigma </td><td> P6407 </td></tr><tr><td> Laminin </td><td> Cultrex </td><td> 3400-010-01 </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Roche Diagnostics GmbH </td><td> 9002-93-1 </td></tr><tr><td> Normal Keçi Serum </td><td> Gibco </td><td> 16210 </td></tr><tr><td> DAPI ile VectaShield </td><td> Vektör Laboratuvarları </td><td> H-1200 </td></tr><tr><td> Ekim </td><td> Doku-Tek </td><td> 4583 </td></tr><tr><td> Tris-Baz (50 mM) </td><td> Balıkçı </td><td> BP152-5 </td></tr><tr><td> Sığır Serum Albumin </td><td> Sigma </td><td> A2153 </td></tr><tr><td> l-lizin </td><td> Sigma </td><td> L-1137 </td></tr><tr><td> % 16 PFA çözüm </td><td> Elektron Mikroskopi Bilimler </td><td> 15711 </td></tr><tr><td> Granül PFA </td><td> Elektron Mikroskopi Bilimler </td><td> 19210 </td></tr><tr><td> 24 kuyu kültür plaka </td><td> Şahin </td><td> 35-3047 </td></tr><tr><td> Keçi anti-fare Alexa konjuge antikorların </td><td> Invitrogen </td><td> --- </td></tr><tr><td> Besleme </td><td> Şirket </td><td> Cat. Hayır. </td></tr><tr><td> 12mm, No: 0 cam lamelleri </td><td> Karl Hecht Gmbh </td><td> 1105209 </td></tr><tr><td> No 1.5 cam lamel (dilim için) </td><td> VWR Bilimsel </td><td> 48393241 </td></tr><tr><td> Cam slaytlar </td><td> VWR Bilimsel </td><td> 48311-703 </td></tr></tbody></table>

quantifying synapses: an immunocytochemistry-based assay to quantify synapse number

Nörobilim en önemli hedeflerinden biri talimat sinaps oluşumu erken aşamalarında moleküler ipuçları anlamak için. Gibi sinaptik bağlantı değişiklikleri ölçmek için objektif yaklaşımlar geliştirmek zorunlu hale gelmiştir. Örnek fiksasyon itibaren, bu protokol detaylarının nasıl ayrışmış nöronal kültür ve immünsitokimya kullanarak beyin bölümlerinde de sinaps sayısı ölçmek için. Kompartman-spesifik antikorların kullanarak, presinaptik terminalleri yanı sıra postsinaptik uzmanlık siteleri etiket. Biz bu belirteçler tarafından oluşturulan sinyaller arasındaki sinaps ko noktaları olarak tanımlar. Bu colocalizations sayısı ImageJ analiz yazılımı platformu altında Puncta Analyzer (istek üzerine Bary Wark, c.eroglu @ cellbio.duke.edu yazılı) bir eklenti kullanarak miktarı. Bu protokol açıklanan sinaps tahlil seçici pre-ve postsinaptik belirteçlerinin sahip olduğunuz herhangi bir sinir doku veya kültür hazırlama uygulanabilir. Bu Sinaps tahlil, sinaptik gelişme çalışmada yaygın olarak kullanılan değerli bir araçtır.

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Synapses: an Immunocytochemistry-based Assay to Quantify Synapse Number at JoVE.com

Quantifying Synapses: an Immunocytochemistry-based Assay to Quantify Synapse Number

Bu protokol, ayrışmış nöronal kültür ve immünsitokimya kullanarak beyin bölümlerinde de sinaps sayısını ölçmek için nasıl ayrıntıları. Kompartman-spesifik antikorların kullanarak, presinaptik terminalleri yanı sıra postsinaptik uzmanlık siteleri etiket. Biz bu belirteçler tarafından oluşturulan sinyaller arasındaki sinaps ko noktaları olarak tanımlar.

Sinapslar miktarının: Synapse Numarası ölçmek için bir İmmünositokimya tabanlı Testi

One of the most important goals in neuroscience is to understand the molecular cues that instruct early stages of synapse formation. As such it has become ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

Hücre Testi Şekillendirme Sinir-Koloni: Sinir Progenitör Hücreler Bona Fide Sinir Kök Hücreler Ayırım Bir Testi

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

An Engulfment Assay: A Protocol to Assess Interactions Between CNS Phagocytes and Neurons

Bir yutulma Deneyi: CNS Fagositler ve nöronlar arasındaki etkileşimi değerlendirmek için bir protokol

Phagocytosis is a process in which a cell engulfs material (entire cell, parts of a cell, debris, etc.) in its surrounding extracellular environment and ...

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

Retina Şerit Sinapslar at Membran Reseptör Yüksek Çözünürlüklü Sayısal immunogold Analizi

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Recording Hücre içi Gerilim Yanıtları için Elektrofizyolojik Yöntem<em&gt; Drosophila</em&gt; Işık Uyaranların için Fotoreseptörler ve internöronlar<em&gt; İn Vivo</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila

Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila

Kitle Histoloji nörodejenerasyon belirlememize<em&gt; Drosophila</em

Progressive neurodegenerative diseases like Alzheimer&#39;s disease (AD) or Parkinson&#39;s disease (PD) are an increasing threat to human health ...

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

Hipokampal kemirgen beyin dilimleri dansitesi Synapse değerlendirilmesi

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...

Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

Yüksek içerik miktar Sod1 canlı hücreler Mutant Protein toplama oluşumu için tahlil geliştirme

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc ...

Visualization of Thalamocortical Axon Branching and Synapse Formation in Organotypic Cocultures

Görselleştirme Thalamocortical Axon dallanma ve sinaps oluşumunda Organotypic Cocultures

Axon branching and synapse formation are crucial processes for establishing precise neuronal circuits. During development, sensory thalamocortical (TC) ...

An Improved Method for Collection of Cerebrospinal Fluid from Anesthetized Mice

Beyin omurilik sıvısı imzalat fareler gelen topluluğu için geliştirilmiş bir yöntem

The cerebrospinal fluid (CSF) is a valuable body fluid for analysis in neuroscience research. It is one of the fluids in closest contact with the central ...

Purification of the Dendritic Filopodia-rich Fraction

Dendritic Filopodia-zengin kesir arıtma

Dendritic filopodia are thin and long protrusions based on the actin filament, and they extend and retract as if searching for a target axon. When the ...