Name: in vivo and in vitro studies of adaptor-clathrin interaction
Uploaded: 2011-01-26T23:30:00
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DF wird von einem NSF Brücken in die Promotion Stipendium gefördert. Das Mikroskop in dieser Arbeit verwendet wird teilweise durch das Mikroskop Imaging Network Kerninfrastruktur Zuschuss von der Colorado State University unterstützt. Die Arbeiten an Clathrin-Adapter in Laboratorium des Autors wird von CSU Start-up-Fonds und der American Heart Association ausgezeichnet 09SDG2280525 auf SD unterstützt

1. Der Einbau eines GFP-Tag und Selektionsmarker in der SLA1 Gen Übernehmen Sie die Longtine Methode 17, um eine GFP-Tag direkt Sicherung am 3 &#39;Ende des Gens SLA1 open reading frame (Sla1p C-Terminus) und gleichzeitig markieren das Gen mit dem E. coli kan r-Gen, das für die G418-Selektion ermöglicht. <ol><li> Generieren Sie ein DNA-Fragment mittels PCR unter Verwendung als Vorlage das Plasmid pFA6a-GFP (S65T)-kanMX6 18 und den folgenden Prim...

<ol>
	<li>Mellman, I., Warren, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+road+taken:+past+and+future+foundations+of+membrane+traffic.">The road taken: past and future foundations of membrane traffic.</a> Cell. 100, 99-112 (2000).</li><li>Engqvist-Goldstein, A. E., Drubin, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+assembly+and+endocytosis:+from+yeast+to+mammals.">Actin assembly and endocytosis: from yeast to mammals.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 19, 287-332 (2003).</li><li>Conner, S. D., Schmid, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+portals+of+entry+into+the+cell.">Regulated portals of entry into the cell.</a> Nature. 422, 37-44 (2003).</li><li>Bonifacino, J. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NPFXD-mediated+endocytosis+is+required+for+polarity+and+function+of+a+yeast+cell+wall+stress+sensor.">NPFXD-mediated endocytosis is required for polarity and function of a yeast cell wall stress sensor.</a> Mol Biol Cell. 18, 57-65 (2007).</li></ol>

Clathrin-beschichteten Vesikeln (CCV) in Endozytose und Transport vom trans-Golgi-Netzwerk zu beteiligen und Endosomen, konservierte Signalwege, die von grundlegender Bedeutung für eukaryotischen Zelle Biologie. Die Ansätze in diesem Papier beschrieben Methoden sind nützlich, um die molekularen Mechanismen, die für CCV Bildung, insbesondere Wechselwirkungen zwischen Proteinen und Adapter Clathrin zu studieren. GST-Fusionsprotein Affinität und Co-Immunopräzipitation Assays erlauben Prüfung der physikalisc...

<table border="1"><th> Material </th><th> Firma </th><tbody><tr><td> QuickChange-XL Mutagenese-Kit </td><td> Stratagene </td></tr><tr><td> Protease-Inhibitor-Cocktail </td><td> Sigma </td></tr></tbody></table>

in vivo and in vitro studies of adaptor-clathrin interaction

Ein großer endocytischen initiiert mit der Bildung von Clathrin-coated Vesikel (CCVS), dass der Transport Fracht von der Zelloberfläche bis 1-6 Endosomen. CCVs sind durch eine polyedrische Gitter Clathrin, dass Coats die Vesikelmembran aus und dient als mechanischer Gerüst. Clathrin Mäntel sind während der Vesikelbildung aus einzelnen Clathrin triskelia, die lösliche Form von Clathrin von drei schweren und drei leichten Kette Untereinheiten zusammengesetzt 7,8 montiert. Da die triskelion nicht über die Fähigkeit, sich an die Membran direkt zu binden, sind Clathrin-bindenden Adapter entscheidend für die Bildung von Clathrin Gitter an der Membran Link durch die Verbindung mit Lipiden und / oder Membranproteine ​​9. Adapter auch Paket Transmembranprotein Fracht, wie Rezeptoren und können untereinander und mit anderen Komponenten des CCV-Maschinerie 9 interagieren. Über zwanzig Clathrin-Adapter sind beschrieben worden, mehrere sind in der Clathrin vermittelten Endozytose beteiligt und andere lokalisieren, die trans-Golgi-Netzwerk oder Endosomen 9. Mit Ausnahme der HIP1R (Hefe Sla2p), binden alle bekannten Clathrin-Adapter auf die N-terminal-Propeller-Domäne des Clathrin schwere Kette 9. Clathrin-Adapter sind modular Proteinen bestehend aus gefalteten Domänen von unstrukturierten flexible Linker verbunden. Innerhalb dieser Linker Regionen, vermitteln kurze Bindungsmotive Interaktionen mit dem Clathrin N-terminalen Domäne oder andere Komponenten des Vesikelbildung Maschinen 9. Zwei verschiedene Clathrin-bindenden Motive wurden definiert: die Clathrin-Box und die W-Box-9. Der Konsens Clathrin-Box-Sequenz wurde ursprünglich definiert als L [L / I] [D / E / N] [L / F] [D / E] 10, aber Varianten wurden anschließend 11 entdeckt. Das W-Feld entspricht der Reihenfolge PWxxW (wobei x jede Rückstand). Sla1p (Synthetic Lethal mit Actin bindendes Protein-1) wurde ursprünglich als ein Aktin-assoziierten Protein identifiziert und ist notwendig für den normalen Aktin-Zytoskelett Struktur und Dynamik bei endocytischen Standorten in Hefezellen 12. Sla1p bindet auch die NPFxD endocytischen Sortierung Signal und ist entscheidend für die Endozytose von Fracht mit der NPFxD Signal 13,14. In jüngerer Zeit Sla1p Es wurde gezeigt, binden durch ein Motiv ähnlich wie die Clathrin Box, LLDLQ Clathrin, bezeichnet eine Variante Clathrin-box (VCB), und als endocytischen Clathrin Adapter 15-Funktion. Darüber hinaus hat Sla1p zu einem weit verbreiteten Marker für die endocytischen Mantel in lebenden Zellen Fluoreszenz-Mikroskopie Studien 16. Hier verwenden wir Sla1p als Modell, Ansätze für Adapter-Clathrin Studien zu Wechselwirkungen zu beschreiben. Wir konzentrieren uns auf Live-Cell-Fluoreszenz-Mikroskopie, GST-Pull-Down-und Co-Immunopräzipitation Methoden.

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In vivo and in vitro Studies of Adaptor-clathrin Interaction

Clathrin-vermittelte Endozytose hängt Adapter Proteine, die Fracht Auswahl und Clathrin-Mantel Montage zu koordinieren. Hier beschreiben wir Verfahren, die Adapter-Clathrin physikalische Interaktion und Live Cell Imaging Ansätze benutzt als Modell die Hefe endocytischen Adapter-Protein Sla1p studieren.

In vivo und in vitro Studien zur Adapter-Clathrin Interaction

A major endocytic pathway initiates with the formation of clathrin-coated vesicles (CCVs) that transport cargo from the cell surface to endosomes1-6. CCVs ...

Research

JoVE Journal

Biology

In vivo and in vitro Studies of Adaptor-clathrin Interaction

In vitro and in vivo Bioluminescence Reporter Gene Imaging of Human Embryonic Stem Cells

In vitro und in vivo Biolumineszenz Reporter Gene Imaging von humanen embryonalen Stammzellen

The discovery of human embryonic stem cells (hESCs) has dramatically increased the tools available to medical scientists interested in regenerative ...

Forschung

Biologie

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

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Patch-Clamp-und Perfusion Techniken zur Untersuchung von Ionenkanälen ausgedrückt in Xenopus Oozyten

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

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Visualisierung der MG53-vermittelte Cell Membrane Repair mit In vivo Und In-vitro- Systems

Repair of acute injury to the cell membrane is an elemental process of normal cellular physiology, and defective membrane repair has been linked to many ...

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Isolierung von Ribosom gebunden Nascent Polypeptide<em&gt; In-vitro-</em&gt; Identifizieren Translational Pause Standorten entlang mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

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Stimulation der DNA-Sensing Zytoplasmatische Pathways<em&gt; In-vitro-</em&gt; Und<em&gt; In Vivo</em

In order to efficiently stimulate an innate immune response, DNA must be of sufficient length and purity. We present a method where double stranded DNA ...

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In - vivo - Studie der menschlichen Endothelial-pericyte Interaktion Mit dem Matrix - Gel - Plug - Assay in der Maus

Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell ...

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The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the ...

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Isolierung von kardialen und vaskulären glatten Muskelzellen aus adulten, juvenilen, Larven und embryonalen Zebrafischen für elektrophysiologische Studien

Zebrafish have long been used as a model vertebrate organism in cardiovascular research. The technical difficulties of isolating individual cells from the ...

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Plant cells use different structural mechanisms, either constitutive or inducible, to defend themselves from fungal infection. Encapsulation is an ...