Name: in vivo and in vitro studies of adaptor-clathrin interaction
Uploaded: 2011-01-26T23:30:00
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DFは、博士のフェローシップへのNSFのブリッジによってサポートされています。本研究で使用した顕微鏡は、コロラド州立大学から顕微鏡イメージングネットワークコアインフラ助成金によって部分的にサポートされています。著者の研究室でのクラスリンアダプターの作業は、CSUスタートアップ資金と米国心臓協会賞SDへ09SDG2280525でサポートされています

1。 SLA1遺伝子にGFPのタグと選択マーカーの取り込み SLA1遺伝子のオープンリーディングフレーム（Sla1p C -末端）の3&#39;末端に直接GFPのタグを融合させると同時に、E.との遺伝子をマークするためにLongtine法17を適用するG418選択を可能にする大腸菌館r遺伝子。 <ol><li>フォワード、5&#39; - CA AGG CAA GCC AAC ATA TTC AAT GCT ACT GCA TCA AAT CCG TTT GGA TTC CG...

<ol>
	<li>Mellman, I., Warren, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+road+taken:+past+and+future+foundations+of+membrane+traffic.">The road taken: past and future foundations of membrane traffic.</a> Cell. 100, 99-112 (2000).</li><li>Engqvist-Goldstein, A. E., Drubin, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+assembly+and+endocytosis:+from+yeast+to+mammals.">Actin assembly and endocytosis: from yeast to mammals.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 19, 287-332 (2003).</li><li>Conner, S. D., Schmid, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+portals+of+entry+into+the+cell.">Regulated portals of entry into the cell.</a> Nature. 422, 37-44 (2003).</li><li>Bonifacino, J. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+vital+stain+for+visualizing+vacuolar+membrane+dynamics+and+endocytosis+in+yeast.">A new vital stain for visualizing vacuolar membrane dynamics and endocytosis in yeast.</a> J Cell Biol. 128, 779-792 (1995).</li><li>Sikorski, R. S., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+of+shuttle+vectors+and+yeast+host+strains+designed+for+efficient+manipulation+of+DNA+in+Saccharomyces+cerevisiae.">A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 122, 19-27 (1989).</li><li>Piao, H. L., Machado, I. M., Payne, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NPFXD-mediated+endocytosis+is+required+for+polarity+and+function+of+a+yeast+cell+wall+stress+sensor.">NPFXD-mediated endocytosis is required for polarity and function of a yeast cell wall stress sensor.</a> Mol Biol Cell. 18, 57-65 (2007).</li></ol>

クラスリン被覆小胞（CCV）は、 トランスゴルジネットワークからエンドサイトーシスおよびトランスポートに参加し、真核細胞生物学の基礎となる保存経路をエンドソーム。このメソッドは用紙に記載されてのアプローチは、アダプタータンパク質とクラスリンとの間の特定の相互作用において、CCVの形成に関与する分子メカニズムを研究するために便利です。 GST -融合タンパク質の...

<table border="1"><th>材料</th><th>会社</th><tbody><tr><td>クイックチェンジ- XL部位特異的突然変異誘発キット</td><td>ストラタジーン</td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤カクテル</td><td>シグマ</td></tr></tbody></table>

in vivo and in vitro studies of adaptor-clathrin interaction

主要なエンドサイトーシス経路は、細胞表面からの輸送貨物は1-6エンドソームにいるクラスリン被覆小胞（CCVS）の形成を開始します。 CCVSは、そのクラスリンコート小胞の膜の多面体格子によって区別し、機械的な足場として機能している。クラスリンコートは個々のクラスリンtriskelionの複数形、三の重三軽鎖サブユニット7,8から構成されるクラスリンの可溶性形態から小胞形成の間に組み立てられます。三脚ともえ紋が直接細胞膜に結合する能力を持っていないため、クラスリン結合アダプタは、脂質および/ ​​または膜タンパク質9で会合を介して膜に成形クラスリン格子をリンクするために重要です。アダプタには、パッケージの膜貫通タンパク質のような受容体などの貨物、、とお互いに、CCVの形成機構9の他のコンポーネントとやり取りすることができます。 20以上のクラスリンアダプターは、記載されているいくつかは、クラスリン依存性エンドサイトーシスに関与していると他の人は、トランスゴルジネットワークに局在または9をエンドソーム。 HIP1R（酵母Sla2p）を除いて、すべての既知のクラスリンアダプターは、クラスリン重鎖9のN末端​​-プロペラドメインに結合する。クラスリンアダプターの構造化されていない柔軟なリンカーで接続された折りたたまれたドメインで構成されるモジュラータンパク質である。これらのリンカー領域内で、短い結合モチーフはクラスリンのN -末端ドメインまたは小胞の形成機構9の他のコンポーネントとの相互作用を媒介する。二つの異なるクラスリン結合モチーフが定義されています：クラスリンボックスとW -ボックス9。コンセンサスクラスリンボックスシーケンスはもともとLとして定義されていた[L / I] [D / E / N] [L / F] [D / E] 10しかし、変種、その後11を発見されている。 W -ボックスは、シーケンスPWxxW（xは任意の残留物である）に準拠しています。 Sla1pは（アクチン結合タンパク質- 1で合成致死）もともとアクチン関連タンパク質として同定し、酵母細胞12のエンドサイトーシスのサイトで通常のアクチン細胞骨格の構造とダイナミクスのために必要ですれました。 Sla1pもNPFxDエンドサイトーシスのソートの信号を結合し、NPFxD信号13,14を担持する貨物のエンドサイトーシスに重要である。最近では、Sla1pはクラスリンボックス、LLDLQに似てモチーフを介してクラスリン結合することが実証された、バリアントクラスリンボックス（VCB）と呼ばれ、エンドサイトーシスのクラスリンアダプター15として機能する。さらに、Sla1pは生細胞の蛍光顕微鏡の研究16におけるエンドサイトーシスのコートに広く使用されているマーカーとなっています。ここでは、アダプタクラスリンの相互作用の研究のためのアプローチを記述するモデルとしてSla1pを使用してください。我々は、生細胞の蛍光顕微鏡に焦点を当てる、ダウンGST -プル、および共免疫沈降法。

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In vivo and in vitro Studies of Adaptor-clathrin Interaction

クラスリン依存性エンドサイトーシスは、貨物の選択とクラスリン被覆のアセンブリを調整するアダプタータンパク質に依存します。ここではモデルとして酵母エンドサイトーシスのアダプタータンパク質のSla1pを使用してアダプタクラスリンの物理的相互作用および生細胞イメージングのアプローチを研究するための手順を説明します。

in vivoおよびアダプター、クラスリンの相互作用のin vitro試験

A major endocytic pathway initiates with the formation of clathrin-coated vesicles (CCVs) that transport cargo from the cell surface to endosomes1-6. CCVs ...

Research

JoVE Journal

Biology

In vivo and in vitro Studies of Adaptor-clathrin Interaction

In vitro and in vivo Bioluminescence Reporter Gene Imaging of Human Embryonic Stem Cells

in vitroおよびヒト胚性幹細胞のin vivoでの生物発光レポーター遺伝子イメージングの

The discovery of human embryonic stem cells (hESCs) has dramatically increased the tools available to medical scientists interested in regenerative ...

生物学

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

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イオンチャネル研究のためのパッチクランプおよび灌流のテクニックで表さアフリカツメガエル卵母細胞

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

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使用してMG53を介した細胞膜修復の可視化 in vivoでと in vitroでシステム

Repair of acute injury to the cell membrane is an elemental process of normal cellular physiology, and defective membrane repair has been linked to many ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

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リボソーム結合した新生ポリペプチドの分離<em&gt; in vitroで</em&gt; mRNAに沿って並進一時サイトを識別するために

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo

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細胞質DNAセンシング経路の刺激<em&gt;体外</em&gt;と<em&gt;インビボ</em

In order to efficiently stimulate an innate immune response, DNA must be of sufficient length and purity. We present a method where double stranded DNA ...

In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

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Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell ...

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腸管上皮細胞の透磁率を決定する体外と体内アプローチ

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In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

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イン・ヴィトロ E3ユビキチンリガーゼ関数の解析

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the ...

Isolation of Cardiac and Vascular Smooth Muscle Cells from Adult, Juvenile, Larval and Embryonic Zebrafish for Electrophysiological Studies

電気生理学的研究のための成体、幼若、幼虫および胚性ゼブラフィッシュからの心臓および血管平滑筋細胞の単離(英語)

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Plant cells use different structural mechanisms, either constitutive or inducible, to defend themselves from fungal infection. Encapsulation is an ...