Name: transfection and mutagenesis of target genes in mosquito cells by locked nucleic acid-modified oligonucleotides
Uploaded: 2010-12-26T15:00:00
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हम कैलिफोर्निया cytometry प्रवाह के साथ उसे सहायता के लिए नेशनल प्राइमेट रिसर्च सेंटर में Abbie स्पिनर धन्यवाद देना चाहूंगा. इस अध्ययन एलर्जी और संक्रामक रोगों के राष्ट्रीय संस्थान (NIAID) के राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) AI073745, AI080799, और AI078183 से धन के द्वारा समर्थित किया गया था.

<ol><li> प्रोटोकॉल शुरू करने से पहले, यह निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है कि मच्छर प्रयोग में इस्तेमाल किया कोशिकाओं को स्वस्थ हैं और ~ 80% संगम पर अगर अनुयायी (चित्रा 1). ऊंचा हो गया या अस्वस्थ कोशिकाओं को कम अभिकर्मक ...

<ol>
	<li>Corby-Harris, V. D. A., Watkins de Jong, L., Pakpour, N., Antonova, Y., Ziegler, R., Ramberg, F., Lewis, E. E., Brown, J. M., Luckhart, S. L., Riehle, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+strategy+for+controlling+malaria+transmission+in+the+mosquito+Anopheles+stephensi.">A novel strategy for controlling malaria transmission in the mosquito Anopheles stephensi.</a> PLOS Pathogens. , (2010).</li><li>Braasch, D. A., Corey, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locked+nucleic+acid+(LNA):+fine-tuning+the+recognition+of+DNA+and+RNA.">Locked nucleic acid (LNA): fine-tuning the recognition of DNA and RNA.</a> Chem Biol. 8, 1-7 (2001).</li><li>Andrieu-Soler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+transmission+of+targeted+gene+modification+using+single-stranded+oligonucleotides+with+flanking+LNAs.">Stable transmission of targeted gene modification using single-stranded oligonucleotides with flanking LNAs.</a> Nucleic Acids Res. 33, 3733-3742 (2005).</li><li>Parekh-Olmedo, H., Drury, M., Kmiec, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+nucleotide+exchange+in+Saccharomyces+cerevisiae+directed+by+short+oligonucleotides+containing+locked+nucleic+acids.">Targeted nucleotide exchange in Saccharomyces cerevisiae directed by short oligonucleotides containing locked nucleic acids.</a> Chem Biol. 9, 1073-1084 (2002).</li><li>Rhee, W. J., Santangelo, P. J., Jo, H., Bao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+accessibility+and+signal+specificity+in+live-cell+detection+of+BMP-4+mRNA+using+molecular+beacons.">Target accessibility and signal specificity in live-cell detection of BMP-4 mRNA using molecular beacons.</a> Nucleic Acids Res. 36, e30-e30 (2008).</li><li>Marras, S. A., Kramer, F. R., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotyping+SNPs+with+molecular+beacons.">Genotyping SNPs with molecular beacons.</a> Methods Mol Biol. 212, 111-128 (2003).</li><li>Tyagi, S., Bratu, D. P., Kramer, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+molecular+beacons+for+allele+discrimination.">Multicolor molecular beacons for allele discrimination.</a> Nat Biotechnol. 16, 49-53 (1998).</li><li>Blandin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+genetic+basis+of+resistance+to+malaria+parasites+in+Anopheles+gambiae.">Dissecting the genetic basis of resistance to malaria parasites in Anopheles gambiae.</a> Science. 326, 147-150 (2009).</li><li>Niare, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+loci+affecting+resistance+to+human+malaria+parasites+in+a+West+African+mosquito+vector+population.">Genetic loci affecting resistance to human malaria parasites in a West African mosquito vector population.</a> Science. 298, 213-216 (2002).</li><li>Riehle, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+malaria+infection+in+Anopheles+gambiae+is+regulated+by+a+single+genomic+control+region.">Natural malaria infection in Anopheles gambiae is regulated by a single genomic control region.</a> Science. 312, 577-579 (2006).</li></ol>

यहाँ हम इन विट्रो विधि और सबूत लक्षित रूपांतरण के लिए एक episomal जीन लक्ष्य में एक एकल nucleotide के LNA-ons - ए में अभिकर्मक के बाद में एक वर्तमान stephensi और ए gambiae कोशिकाओं. LNA पर की मध्यस्थता जीन रूपांतरण एक ?...

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Effectene transfection reagent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>301425</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GFP control plasmid (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-neg)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>K4935-00</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BFP plasmid (pcDNA5/FRT/TO)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gift from Dr. Concordet3</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LNA-ONs </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gift from Dr. Concordet3</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MEM, Earle's w/ glutamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11095</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal calf serum (FCS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>16000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Schneider&#x2019;s Drosophila medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11730</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Non-essential amino acids</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10% D-glucose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G5767</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin-streptomycin antibiotic</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>6-well culture plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>3516</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

transfection and mutagenesis of target genes in mosquito cells by locked nucleic acid-modified oligonucleotides

प्लाज्मोडियम परजीवी, मलेरिया की प्रेरणा का एजेंट, संक्रमित एनोफ़ेलीज़ हर साल 250 से अधिक मिलियन नए संक्रमण में जिसके परिणामस्वरूप मच्छरों के काटने के माध्यम से प्रेषित कर रहे हैं. अनुसंधान के दशकों के बावजूद, वहाँ अभी भी मलेरिया के खिलाफ कोई टीका नहीं है, उपन्यास नियंत्रण रणनीति के लिए की जरूरत पर प्रकाश डाला. आनुवंशिक रूप से संशोधित मच्छरों की एक नवीन दृष्टिकोण का उपयोग करने के लिए प्रभावी ढंग से मलेरिया परजीवी संचरण नियंत्रण है. मच्छर में सेल संकेत दे रास्ते की जानबूझकर लक्षित mutagenesis के माध्यम से, परिवर्तन, परजीवी के विकास को विनियमित 1 करने के लिए पाया गया है. इन अध्ययनों से हम परिवर्तन के लिए संभावित जीन लक्ष्यों की पहचान शुरू कर सकते हैं. लक्षित mutagenesis के पारंपरिक रूप से एक लक्ष्य जीन और एक बड़े डीएनए अणु के बीच मुताबिक़ पुनर्संयोजन पर भरोसा है. हालांकि, निर्माण और stably तब्दील सेल लाइनों की पीढ़ी के लिए ऐसी जटिल डीएनए अणु के उपयोग महंगा, समय लेने वाली और अक्सर अक्षम है. इसलिए, एक रणनीति का उपयोग बंद न्यूक्लिक एसिड संशोधित oligonucleotides (LNA-ons) episomal और गुणसूत्र डीएनए जीन लक्ष्य (2 में समीक्षा) में कृत्रिम एकल nucleotide substitutions के शुरू करने के लिए एक उपयोगी विकल्प प्रदान करता है. LNA पर मध्यस्थता लक्षित mutagenesis के दोनों खमीर और 3,4 चूहों के सभ्य कोशिकाओं में ब्याज की जीन में बिंदु उत्परिवर्तन परिचय करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. हम यहाँ दिखाने के लिए कि LNA-ons एक ट्रांसफ़ेक्ट episomal लक्ष्य में एक एकल nucleotide परिवर्तन है कि नीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति (BFP) से दोनों एनोफ़ेलीज़ gambiae और एनोफ़ेलीज़ stephensi कोशिकाओं में हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति (GFP) के लिए स्विच में परिणाम परिचय के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है . यह पहली बार है कि मच्छर की कोशिकाओं में लक्ष्य जीन की प्रभावी mutagenesis LNA-ons द्वारा मध्यस्थता हो सकता है और पता चलता है कि इस तकनीक इन विट्रो में और vivo में गुणसूत्र लक्ष्य के mutagenesis के लिए लागू किया जा सकता है के लिए रूपांतरण को दर्शाता है.

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Transfection and Mutagenesis of Target Genes in Mosquito Cells by Locked Nucleic Acid-modified Oligonucleotides

Oligonucleotides साइट के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है विशेष रूप से दोनों में ट्रांसफ़ेक्ट लक्ष्य जीन की एक एकल nucleotide विकल्प<em&gt; एनोफ़ेलीज़ gambiae</em&gt; और<em&gt; एनोफ़ेलीज़ stephensi</em&gt; कोशिकाओं.

और न्यूक्लिक एसिड संशोधित oligonucleotides ताला द्वारा मच्छर कक्ष में लक्ष्य जीन की mutagenesis अभिकर्मक

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