Name: recapitulation of an ion channel iv curve using frequency components
Uploaded: 2011-02-08T16:00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Recapitulation of an Ion Channel IV Curve Using Frequency Components at JoVE.com

وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح عدد R21 - 01 - HL094828 منحت لPoelzing د.

1. تعد الدالة والضوضاء إشارة الإدخال <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنشاء دالة الضوضاء التي تحتوي على عناصر الترددات المطلوبة. ويمكن القيام بذلك عن طريق تصف مكونات التردد المطلوب في المجال تردد ومن ثم حساب تحويل فورييه العكسية السريعة. في هذه الدراسة ، 1 -- كان يستخدم 15 كيلو هرتز. وحسبت جميع تحويلات فورييه وتحويل فورييه العكسية وصفها في هذه الدراسة باستخدام FFT مطلب وظائف IFFT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مقياس السعة وظيفة الضوضاء بشكل مناسب. في هذه الدراسة تم تحجيمها وظيفة مثل هذه الضوضاء التي الصفر إلى ذروة سعة الدالة ضجيج بلغ 50 أو 100 فولت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنشاء ملف التحفيز باستخدام الأساليب المناسبة لاقتناء البرمجيات المستخدمة. لClampex 8 ، أولا إنشاء ملف نصي مع رأس المناسبة. دون رأس ، تضاف الزيادات الوقت لحملة واحدة في العمود الأول. ينبغي للزيادات الوقت نفسه يكون التباعد الزمني الفاصل كما أخذ العينات المستخدمة في القياسات. لكل اكتساح في البروتوكول خطوة الجهد إدراج الفولتية بالضبط المطلوب في كل خطوة الوقت. وينبغي أن تشمل هذه الدالة الضوضاء. </li></ol> 2. إجراء قياسات الجهد المشبك <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنشاء بروتوكول القياس ضمن برنامج الاستحواذ والتي تتوافق مع ملف التحفيز ولدت من قبل. في Clampex ، هناك القائمة التي تسمح للمستخدم لربط ملف التحفيز مع البروتوكول الحالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إرفاق نموذج (أو البيولوجية) الخلية إلى معدات القياس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنفيذ التجربة كما كان مقررا. لأغراض المراقبة ، للتأكد من القياسات الدورية التي لا تتضمن أية وظائف الضوضاء. </li></ol> 3. آخر تجربة التحليل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب منحنى الرابع لتسجيل الفردية. إذا كان التسجيل هو في حالة مستقرة عند تطبيق الدالة ضجيج ، يمكن إنشاء منحنى رابعا استخدام جزء من حالة مستقرة تسجيل مؤقتا خارج نطاق الدالة الضوضاء. إذا لم يكن في تسجيل حالة مستقرة ، وظيفة الضوضاء قد تتداخل مع حساب منحنى الرابع ، لذلك ينبغي أن يتم تسجيل وظيفة ثانية دون ضجيج الحالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل خطوة الجهد في تسجيل حساب تحويل فورييه سريع لجزء من التسجيل ، حيث تم إدراج الدالة الضوضاء. الجمع بين تحويل فورييه لكل خطوة الجهد في مصفوفة amxn ، حيث m هو عدد من الترددات في الاتحاد الفرنسي للتنس ، و n هو عدد من الخطوات الجهد. في هذا التكوين ، كل صف من المصفوفة يمثل اتساع وتيرة واحدة في جميع مراحل الجهد في التجربة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل تردد (أي كل صف في المصفوفة أعلاه) ربط الصفوف مع منحنى ولدت في الرابع وسجل 3.1 معامل الارتباط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مؤامرة ضد معامل الارتباط لتصور تردد الترددات العالية التي تترابط مع المنحنى الرابع. منذ يرد المكون داخل العاصمة وتيرة الأول من الاتحاد الفرنسي للتنس ، ينبغي أن معامل الارتباط لهذا التردد يكون دائما&gt; 0.99. </li></ol> 4. ممثل النتائج : وتظهر القياسات ممثل الشبك الجهد لخلية نموذجية دون (الشكل 1A) ومع (الشكل 1B) وظيفة الضجيج إدراجها في البروتوكول خطوة الجهد. وحسبت أيضا منحنى الرابع نموذج للخلية (الشكل 1C). لكل الاجتياح ، في التسجيلات من الشكل 1 ، وكان الاتحاد الفرنسي للتنس على حساب الإطار الزمني حيث تم إدراج الدالة الضوضاء (انظر مربع أحمر في أرقام 1A ، 1B). الأرقام 2A و 2B تظهر FFTs يحسب للتسجيلات تظهر في الشكل و1A 1B ، على التوالي. بناء على الفحص البصري ، المكون العاصمة (أبرزت باللون الأحمر) ويبدو أن تحاكي شكل المنحنى الرابع. من دون ضجيج وظيفة ، وجميع ترددات فوق العاصمة ويبدو أن سعة قريبة من الصفر (الشكل 2A). عند إدراج الدالة الضوضاء ، الترددات بين 1 و 15 كيلو هرتز وسعة ملحوظ بصريا (الشكل 2B). ويبين الشكل 3 نتيجة ربط سعة التردد الفردية عبر سلسلة من الخطوات ضد الجهد المنحنى الرابع. الشكل 3A - C يبين معاملات الارتباط عندما تم إجراء التجربة في ظل ظروف التحكم (أي وظيفة الضجيج) ، وضجيج مع سعة 50 و 100 فولت ، على التوالي. لاحظ في جميع الحالات ، يبدو عنصر لربط العاصمة تماما تقريبا مع المنحنى الرابع. في الواقع ، بالنسبة لجميع التسجيلات ، وكان معامل الارتباط لهذا التردد أكبر من 0.99 (R = 0.9996 ± 1E - 5 ، يعني ± الانحراف المعياري). عندما ننظر في الشكل 3A (شروط السيطرة) ، لا توجد ترددات بجانب المكون العاصمة الذي يرتبط بشكل كبير مع اتساع المنحنى الرابع. على وجه التحديد ، فإن أيا من هذه الترددات ومعاملات الارتباط أكبر من 0.5. الإدراج على وظيفة أدنى ضجيج السعة (50 فولت) ، وهذه الترددات نفسها كانت لا تزال أقل من معاملات الارتباط 0.5. معاملات الارتباط لالترددات ذاتها كما لم تصبح أكبر من 0.5 عندما تمت زيادة السعة إلى 100 الضوضاء بالسيارات. <img src="/files/ftp_upload/2361/2361fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> . الشكل النموذجي للخلية تسجيلات 1 : تظهر التسجيلات المشبك الجهد لخلية نموذجية دون (1A) ومع (1B) وظيفة الضجيج تضمينها في بروتوكول الجهد الخطوة. لأول 20 مللي ثانية والأخير من كل اكتساح ، بقي المحتملة في إمكانية عقد (0 بالسيارات). وكان كل خطوة الجهد 80 مللي طويل ، وأضيفت وظيفة الضوضاء 40 مللي ثانية بعد بداية الخطوة. وكان الضجيج وظيفة مدة 30 مللي ثانية والترددات الواردة بين 1 و 15 كيلو هرتز. وقد كثفت الجهد جيئة وذهابا ، -150 إلى +50 بالسيارات في 5 زيادات بالسيارات. ويظهر أيضا منحنى الرابع نموذج للخلية (1C). تسجيلات لجعل أسهل في القراءة ، أدرج فقط كل اكتساح الخامس في 1A 1B و، ولكن تم إدراج جميع الاحتلالات في 1C. <img src="/files/ftp_upload/2361/2361fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2 FFT التسجيلات : تم احتساب FFT لجزء من كل 30 مللي اكتساح حيث الوظيفة الضجيج هو أن إدراج (المنطقة المحصورة بين مربع أحمر في أرقام 1A ، 1B). الأرقام 2A و 2B تظهر FFTs دون احتساب وظيفة مع الضجيج ، على التوالي. مرة أخرى ، من أجل الوضوح ، يتم تضمين فقط من كل FFT الاجتياح الخامس في الشكل ، ولكن تم استخدام كل الاحتلالات في حسابات المستقبل. <img src="/files/ftp_upload/2361/2361fig3.jpg" alt="الشكل 3" /> وأظهرت نتائج الارتباط بين المنحنى الرابع من تسجيل وسعة الترددات الفردية عبر مجموعة من الخطوات الجهد : الرقم التردد الرابع 3 إرتباطات. الأرقام 1A -- 1C تظهر معامل الارتباط للترددات 0-20 كيلو هرتز في ظل ظروف السيطرة ، وبحضور 50 أو 100 وظائف الضوضاء بالسيارات ، على التوالي. <img src="/files/ftp_upload/2361/2361fig4.jpg" alt="الشكل 4" /> الشكل 4 إعادة إنشاء منحنى رابعا : تم مضافين منحنى الرابع نموذج للخلية (نفس الشكل 1C) وحجم اثنين من الترددات. وكان تردد لأول مرة عنصر العاصمة (R = 0.995) ، والثانية كانت تردد اختيارها عشوائيا مع ارتباط منخفضة (R = 0.3212). وتحجيم سعة التردد في السعة تقريبا نفس المنحنى الرابع.

<ol>
	<li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches.">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).</li><li>Ukomadu, C., Zhou, J., Sigworth, F. J., Agnew, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mu]l+Na++channels+expressed+transiently+in+human+embryonic+kidney+cells:+Biochemical+and+biophysical+properties.">mu]l Na+ channels expressed transiently in human embryonic kidney cells: Biochemical and biophysical properties.</a> Neuron. 8, 663-676 (1992).</li><li>Abriel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Arrhythmogenic+Mechanism+Revealed+by+a+Long-QT+Syndrome+Mutation+in+the+Cardiac+Na++Channel.">Novel Arrhythmogenic Mechanism Revealed by a Long-QT Syndrome Mutation in the Cardiac Na+ Channel.</a> Circ Res. 88, 740-745 (2001).</li><li>Giles, W. R., Imaizumi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+potassium+currents+in+rabbit+atrial+and+ventricular+cells.">Comparison of potassium currents in rabbit atrial and ventricular cells.</a> J Physiol. 405, 123-145 (1988).</li><li>Lee, K. S., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+calcium+channel+blockade+by+verapamil,+D600,+diltiazem+and+nitrendipine+in+single+dialysed+heart+cells.">Mechanism of calcium channel blockade by verapamil, D600, diltiazem and nitrendipine in single dialysed heart cells.</a> Nature. 302, 790-794 (1983).</li><li>Ozdemir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+Inhibition+of+Na/Ca+Exchange+Results+in+Increased+Cellular+Ca2++Load+Attributable+to+the+Predominance+of+Forward+Mode+Block.">Pharmacological Inhibition of Na/Ca Exchange Results in Increased Cellular Ca2+ Load Attributable to the Predominance of Forward Mode Block.</a> Circ Res. 102, 1398-1405 (2008).</li><li>Zhang, S., Zhou, Z., Gong, Q., Makielski, J. C., January, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+Block+and+Identification+of+the+Verapamil+Binding+Domain+to+HERG+Potassium+Channels.">Mechanism of Block and Identification of the Verapamil Binding Domain to HERG Potassium Channels.</a> Circ Res. 84, 989-998 (1999).</li><li>Veeraraghavan, R., Poelzing, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+underlying+increased+right+ventricular+conduction+sensitivity+to+flecainide+challenge.">Mechanisms underlying increased right ventricular conduction sensitivity to flecainide challenge.</a> Cardiovasc. Res. 77, 749-756 (2008).</li><li>Goodman, M., Art, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+feedback+by+a+potassium-selective+inward+rectifier+enhances+tuning+in+vertebrate+hair+cells.">Positive feedback by a potassium-selective inward rectifier enhances tuning in vertebrate hair cells.</a> Biophysical Journal. 71, 430-442 (1996).</li><li>Han, A., Frazier, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+channel+characterization+using+single+cell+impedance+spectroscopy.">Ion channel characterization using single cell impedance spectroscopy.</a> Lab Chip. 6, 1412-1414 (2006).</li><li>Hayashi, H., Fishman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inward+rectifier+K+-channel+kinetics+from+analysis+of+the+complex+conductance+of+Aplysia+neuronal+membrane.">Inward rectifier K+-channel kinetics from analysis of the complex conductance of Aplysia neuronal membrane.</a> Biophysical Journal. 53, 747-757 (1988).</li><li>Millonas, M. M., Hanck, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonequilibrium+response+spectroscopy+of+voltage-sensitive+ion+channel+gating.">Nonequilibrium response spectroscopy of voltage-sensitive ion channel gating.</a> Biophys. J. 74, 210-229 (1998).</li><li>Misakian, M., Kasianowicz, J., Robertson, B., Petersons, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency+response+of+alternating+currents+through+the+Staphylococcus+aureus+alpha-hemolysin+ion+channel.">Frequency response of alternating currents through the Staphylococcus aureus alpha-hemolysin ion channel.</a> Bioelectromagnetics. 22, 487-493 (2001).</li><li>Sale, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+Properties+of+hERG+1a/1b+Heteromeric+Currents+and+a+hERG+1b-Specific+Mutation+Associated+With+Long-QT+Syndrome.">Physiological Properties of hERG 1a/1b Heteromeric Currents and a hERG 1b-Specific Mutation Associated With Long-QT Syndrome.</a> Circ Res. 103, 81-95 (2008).</li><li>Blatz, A. L., Magleby, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+description+of+three+modes+of+activity+of+fast+chloride+channels+from+rat+skeletal+muscle.">Quantitative description of three modes of activity of fast chloride channels from rat skeletal muscle.</a> J Physiol. 378, 141-174 (1986).</li><li>Kuo, J. J., Lee, R. H., Zhang, L., Heckman, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+role+of+the+persistent+sodium+current+in+spike+initiation+during+slowly+rising+inputs+in+mouse+spinal+neurones.">Essential role of the persistent sodium current in spike initiation during slowly rising inputs in mouse spinal neurones.</a> The Journal of Physiology. 574, 819-834 (2006).</li><li>Thompson, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+potassium-channel+selectivity+revealed+by+Na(+)+and+Li(+)+binding+sites+within+the+KcsA+pore.">Mechanism of potassium-channel selectivity revealed by Na(+) and Li(+) binding sites within the KcsA pore.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 16, 1317-1324 (2009).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

هناك عقبات تقنية تمنع في الوقت الحاضر الباحثون من قياس أنواع متعددة في وقت واحد مع قناة أيون النية في وقت لاحق لتحديد مدى الحالية ينبغي أن ينسب إلى كل نوع القناة. وبسبب هذا القيد ، وعادة ما يتم دراسة القنوات الأيونية فردي باستخدام تقنيات مثل المشبك المحتملة الجهد ، والحالية ، والعمل من 1 إلى دراسة أنواع القنوات الفردية ، وغالبا ما تستخدم غيروي نظم التعبير. 2 عند العمل مع الخلايا المعزولة من الأنسجة ، مثل العضلية ، يجب استخدام وسائل أخرى لمنع القنوات الأيونية المختلفة. على سبيل المثال ، يمكن أن يكون المعطل قنوات الصوديوم بواسطة منحدر بطيء depolarizing الجهد ، يمكن أن يكون قد تم حظره الداخل 3 قنوات البوتاسيوم مع تصحيح BaCl2 خارج الخلية ، (4) ويمكن حظر استخدام قنوات الكالسيوم فيراباميل 5 أسلوب واحد يستخدم هذا جزئيا يتغلب على هذا القيد هو قياس التدفق الحالي من خلال أنواع قناتين في وقت واحد ، ثم كرر بعد حظر انتقائي قياس نوع واحد مع وكيل قناة مناسبة. ويمكن بعد ذلك الطرح من القياسين أن تستخدم لتقدير كمية الحالية تعزى إلى نوع القناة التي تم حظرها. 6 ومع ذلك ، هناك نوعان من القيود الرئيسية لهذه التقنية. أولا ، لم يتم تحديد العوامل الكيميائية التي يمكن أن تسد بشكل انتقائي كل قناة أيون ، وبعض الأدوية المستخدمة على نطاق واسع وغير محدد أنواع التفاعلات مع قناة أخرى. 5،7 ثانية ، فإنه لا يمكن تحديد ما إذا كان هذا الأسلوب من قناة واحدة هي عن طريق التضمين أخرى القناة. على سبيل المثال ، فقد تبين التعبير غير متجانسة من NAV 1.5 و 2.1 في البطينين قير خنزير غينيا ، وقيل أن وجود علاقة التآزر القائم بين القناتين ، مثل أن ارتفاع 2.1 قير التعبير في البطين الأيمن يخفض سرعة التوصيل. 8 في الوقت الحاضر ، لا يمكن أن يكون هذا التحقق. في هذه الدراسة ، فإننا نقترح أن التحليل الطيفي مقاومة قد تكون أداة مفيدة لدراسة أنواع متعددة القناة الايونية يقاس في نفس الوقت. لم يكن أبدا على الرغم من الطريقة المستخدمة لتقديم نستشف من أنواع التيارات القناة الثانية يقاس في نفس الوقت ، تم استخدام التحليل الطيفي للمقاومة الدراسة عددا من الجوانب الأخرى من وظيفة القناة الايونية. وأظهرت غودمان والفن باستخدام خلايا الشعر السمعي السلاحف التي يمكن تعديلها بروتوكولات المشبك الحالية لضبط خلية لترددات مختلفة ، والتذبذبات في إمكانات عبر الغشاء هو نتيجة لتفاعل بين الداخل تصحيح قناة + K وقناة + كا 2. تظاهر 9 هان وفرايزر التي يمكن قياسها مقاومة في خلية واحدة على نطاق واسع من الترددات (100 هرتز إلى 5 ميجاهيرتز) ، والزيادة في مقاومة عندما لاحظ K + أو كا 2 + سدت قنوات يمكن أن تكون وسيلة بسيطة ل اكتشاف كتلة في قناة عالية الإنتاجية شاشات المخدرات. فيشمان 10 هاياشي واستخدمت تصرف معقدة لدراسة الخصائص الحركية لتصحيح الداخل قناة + K 11 مجموعات أخرى أدرجت وتيرة واحدة في بروتوكول المشبك الجهد من أنواع مختلفة ، والقناة أظهرت أن وافقت لاحظ تردد الاستجابة مع الاستجابة المتوقعة لبعض الترددات ولكن ليس غيرها. 12،13 Millonas Hanck واقترح بعض الترددات السبب لم ينتج رد الفعل المتوقع هو وجود ثوابت معدل متعددة في نموذج ماركوف (12). مثل هذه الدراسات ، فضلا عن غيرهم ، أثبتت أن هناك حالات عندما التيارات الأيونية تقاس من القنوات الأيونية أثناء استخدام التحليل الطيفي مقاومة لا نتفق مع استجابة التردد النظري. هذا ليس مصدر قلق في هذه الدراسة ، لأن الغرض من هذا الأسلوب في هذه الدراسة هو تحديد الترددات التي ترتبط مع السعة الحالية مستقل من الافتراضات الكامنة وراء غشاء الدائرة الكهربائية. Furtheremore ، يتم حساب السعة الحالية من أجزاء من التسجيلات التي لا تملك أية وظائف الضوضاء إدخالها عليها. وهناك عدد من الدراسات الأخرى أيضا النماذج الحالية للمعرض العديد من القنوات الأيونية إجراء العديد من المنظمات غير التوصيل وجميع الدول مع ثوابته معدل الخاصة. 14،15،16 طومسون وآخرون أظهرت أن فلتر الانتقائية للقناة KcsA ومواقع الربط مختلفة لنا + لي + و K + ، وتكاليف حيوية في الانتقال من موقع واحد ملزم لآخر كما تتحرك ايون من خلال تصفية الانتقائية هو ما يجعل قناة سلوك تفضيلي K + الأيونات من خلال المسام والخمسين. (17) وفي هذه الورقة أدرجنا مجموعة من الترددات (وظيفة الضجيج) في البروتوكول خطوة الجهد وبحثت عن الترددات التي ترتبط السعة العالية السعة مع التيار العام. منذ أن قدمت أدلة قوية تشير ثوابت معدل متعددة تلعب دورا في توصيل الأيونات من خلال differenقد ر القنوات ، وإدخال ترددات المرتبطة بهذه الثوابت معدل ترددات معينة لسبب أو ربط صداها عاليا مع السعة الحالية ، والتي لن يكون على خلاف ذلك. يتم تنفيذ هذا الأسلوب أثبت في هذه الدراسة على خلية النموذج ، الذي هو مواز RC الدوائر التي تستخدم عادة لاختبار الدوائر المشبك الجهد والمعدات الاستحواذ. وليس من المتوقع أن أي الترددات الى جانب العاصمة وترتبط مع حجم الحالية ، وهذا هو مبين في البيانات المتوفرة لدينا. علينا أن نبين أن إضافة وظيفة الضجيج لم يسبب أي الترددات العالية لربط مع السعة الحالية. هذه النتائج الحاسمة هما لأنها تظهر أن معدات القياس وظيفة الضجيج لا في حد ذاتها سببا لربط أي الترددات مع السعة الحالية. الدراسات المستقبلية عند إجراء قياسات باستخدام الأغشية تحتوي على القنوات الأيونية ، ومن المتوقع أنه ، اعتمادا على القناة المستخدمة ، والترددات التي تتوافق مع ثوابت المعدل في تصفية انتقائية أو ربما المسام وسوف تؤثر على استجابة التردد للقناة والتي تؤثر على ترددات عالية و أو ارتباط منخفضة مع السعة الحالية. لأن هذا الأسلوب هو أسلوب جديد لدراسة القنوات الأيونية ، وهناك عدد من الاتجاهات ويمكن متابعة الدراسات المستقبلية. أولا ، ينبغي أن تستخدم هذه التقنية لوصف استجابة التردد لقنوات محددة معزولة. عمل إضافي يحتاج أيضا إلى أن يتم لمعايرة سعة التردد على سعة الحالية. مرة واحدة وتتميز قنوات متعددة بشكل فردي ، يجب أن تقاس أنواع متعددة في نفس الوقت قناة. ويمكن أيضا أن تتكيف هذه التقنية لاستخدامها في عمل محتمل المشبك ، المشبك الحالية ، وتحفيز الدراسات الميدانية. في حين أن هذا هو أسلوب جديد ، فإنه يظهر ما يمكن أن يكون وسيلة قوية لجعل القياسات الكهربية التي كانت في السابق غير ممكن ، وتقديم رؤى جديدة قيمة في دور الفسيولوجية للقنوات أيون.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Matlab</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mathworks</td>
<td>n/a</td>
<td>Natick, MA</td>
</tr>
<tr>
<td>Clampex 8</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>Clampex 8</td>
<td>Sunnyvale, CA</td>
</tr>
<tr>
<td>Integrating Patch Clamp Amplifier</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>Axopatch 200</td>
<td>Sunnyvale, CA</td>
</tr>
<tr>
<td>Headstage</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>CV202</td>
<td>Sunnyvale, CA</td>
</tr>
<tr>
<td>16-Bit Data Acquisition System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>Digidata 1322A</td>
<td>Sunnyvale, CA</td>
</tr>
<tr>
<td>Model Cell</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>Patch 1 Model Cell</td>
<td>Sunnyvale, CA</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

recapitulation of an ion channel iv curve using frequency components

مقدمة : في الوقت الحاضر ، لا توجد وسائل متعددة لقياس أنشئت أنواع القناة الايونية في وقت واحد ، وتتحلل إلى أجزاء قياس الحالية التي تعزى إلى كل نوع القناة. هذه الدراسة توضح كيف يمكن استخدام التحليل الطيفي لتحديد مقاومة الترددات المحددة التي ترتبط إلى حد كبير مع اتساع حالة مستقرة خلال التجارب الحالية قياس الجهد المشبك. الأسلوب ينطوي على إدراج وظيفة الضوضاء التي تحتوي على ترددات محددة في بروتوكول خطوة الجهد. في العمل المقدم ، يتم استخدام خلية نموذج لإثبات أن يتم إدخال أي الارتباطات عالية من قبل الدوائر المشبك الجهد ، كما أن وظيفة الضوضاء في حد ذاته لا يدخل أي الارتباطات عالية عند أي قنوات ايون موجودة. هذا ضروري قبل التحقق من صحة ويمكن تطبيق هذه التقنية لالمستحضرات المحتوية على القنوات الأيونية. الغرض من هذه المقدمة هو بروتوكول لشرح كيفية توصيف استجابة تردد من نوع أيون قناة واحدة إلى وظيفة الضوضاء. مرة واحدة وقد تم التعرف على ترددات محددة في نوع قناة منفردة ، ويمكن استخدامها لإنتاج الحالة الراهنة الجهد المستمر (الرابع) المنحنى. ثم قد الترددات العالية التي ترتبط مع نوع قناة واحدة وربط الحد الأدنى مع أنواع قناة أخرى يمكن استخدامها لتقدير المساهمة الحالية لأنواع متعددة تقاس قناة في وقت واحد. الطريقة : أجريت قياسات المشبك الجهد على خلية باستخدام نموذج خطوة الجهد معيار البروتوكول (-150 إلى +50 بالسيارات ، 5mV الخطوات). أدرجت في كل خطوة الجهد : الوظائف التي تحتوي على مقادير متساوية من الضوضاء من الترددات كيلوهرتز 15/01 (50 أو 100mV الصفر إلى سعة الذروة). تم حساب المكون الحقيقي لتحويل فورييه السريع (FFT) من إشارة الخرج مع وبدون ضجيج المحتملة لكل خطوة. ويرتبط حجم كل تردد بوصفها وظيفة من الخطوة الجهد مع السعة الحالية في الفولتية المقابلة. النتائج والاستنتاجات : في غياب الضوضاء (السيطرة) ، وتراوحت شدتها بين جميع الترددات باستثناء عنصر العاصمة ارتباطا ضعيفا (| R | &lt;0.5) مع منحنى الرابع ، في حين أن عنصر العاصمة كان معامل الارتباط أكبر من 0.999 في جميع القياسات. لم نوعية العلاقة بين الفرد والترددات المنحنى الرابع لم تتغير عندما أضيفت وظيفة الضجيج على البروتوكول خطوة الجهد. وبالمثل ، وزيادة السعة وظيفة الضوضاء كما لا يزيد من الارتباط. قياسات التحكم تثبت أن الدوائر المشبك الجهد في حد ذاته لا يسبب أي ترددات فوق 0 هرتز إلى حد كبير مع ربط منحنى الرابع ثابتة للدولة. وبالمثل ، والقياسات في وجود وظيفة الضوضاء تدل على أن وظيفة الضجيج لا يسبب أي ترددات فوق 0 هرتز إلى ربط مع المنحنى الرابع المطرد للدولة إذا لم تكن هناك قنوات ايون موجودة. على أساس هذا التحقق ، ويمكن الآن طريقة يمكن تطبيقها على المستحضرات التي تحتوي على قناة واحدة نوع أيون بقصد تحديد الترددات التي سعة ربط هذا النوع تحديدا مع القناة.

Watch this Scientific Journal Video about Recapitulation of an Ion Channel IV Curve Using Frequency Components at JoVE.com

Recapitulation of an Ion Channel IV Curve Using Frequency Components

هناك عقبات تقنية لقياس التدفق الحالي من خلال قنوات متعددة في وقت واحد أيون ، والمميزين في وقت لاحق ما جزءا من التيار عبر الغشاء ومن المقرر أن لكل نوع القناة. لتلبية هذه الحاجة ، وهذا الأسلوب يمثل وسيلة لتوليد المنحنى الرابع من أنواع قناة منفردة باستخدام مكونات تردد معين.

خلاصة من المنحنى الرابع ايون القناة باستخدام مكونات التردد

INTRODUCTION: Presently, there are no established methods to measure multiple ion channel types simultaneously and decompose the measured current into ...

recapitulation-of-an-ion-channel-iv-curve-using-frequency-components

Research

JoVE Journal

Biology

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

MALDI تحضير العينة : الترا أسلوب طبقة رقيقة

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Major Components of the Light Microscope

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

مكونات رئيسية مجهر الضوء

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for ...

Homemade Site Directed Mutagenesis of Whole Plasmids

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned target gene can be altered by substitution, deletion or insertion of a few bases directly into a plasmid. It works by simply amplifying the whole plasmid, in a non PCR-based thermocycling reaction. During the reaction mutagenic primers, carrying the desired mutation, are integrated into the newly synthesized plasmid. In this video tutorial we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid. The protocol works with standard reagents and is independent from commercial kits, which often are very expensive. Applying this protocol can reduce the total cost of a reaction to an eighth of what it costs using some of the commercial kits. In this video we also comment on critical steps during the process and give detailed instructions on how to design the mutagenic primers.

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. Here we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid using standard reagents.

الموقع محلية الصنع تطفير موجه من البلازميدات الجامعة

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned ...

Quantifying the Frequency of Tumor-propagating Cells Using Limiting Dilution Cell Transplantation in Syngeneic Zebrafish

Self-renewing cancer cells are the only cell types within a tumor that have an unlimited ability to promote tumor growth, and are thus known as tumor-propagating cells, or tumor-initiating cells. It is thought that targeting these self-renewing cells for destruction will block tumor progression and stop relapse, greatly improving patient prognosis1. The most common way to determine the frequency of self-renewing cells within a tumor is a limiting dilution cell transplantation assay, in which tumor cells are transplanted into recipient animals at increasing doses; the proportion of animals that develop tumors is used the calculate the number of self-renewing cells within the original tumor sample2, 3. Ideally, a large number of animals would be used in each limiting dilution experiment to accurately determine the frequency of tumor-propagating cells. However, large scale experiments involving mice are costly, and most limiting dilution assays use only 10-15 mice per experiment. 
Zebrafish have gained prominence as a cancer model, in large part due to their ease of genetic manipulation and the economy by which large scale experiments can be performed. Additionally, the cancer types modeled in zebrafish have been found to closely mimic their counterpart human disease4. While it is possible to transplant tumor cells from one fish to another by sub-lethal irradiation of recipient animals, the regeneration of the immune system after 21 days often causes tumor regression5. The recent creation of syngeneic zebrafish has greatly facilitated tumor transplantation studies 6-8. Because these animals are genetically identical, transplanted tumor cells engraft robustly into recipient fish, and tumor growth can be monitored over long periods of time. Syngeneic zebrafish are ideal for limiting dilution transplantation assays in that tumor cells do not have to adapt to growth in a foreign microenvironment, which may underestimate self-renewing cell frequency9, 10. Additionally, one-cell transplants have been successfully completed using syngeneic zebrafish8 and several hundred animals can be easily and economically transplanted at one time, both of which serve to provide a more accurate estimate of self-renewing cell frequency.
Here, a method is presented for creating primary, fluorescently-labeled T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) in syngeneic zebrafish, and transplanting these tumors at limiting dilution into adult fish to determine self-renewing cell frequency. While leukemia is provided as an example, this protocol is suitable to determine the frequency of tumor-propagating cells using any cancer model in the zebrafish.

Limiting dilution cell transplantation assays are used to determine the frequency of tumor-propagating cells. This protocol describes a method for generating syngeneic zebrafish that develop fluorescently-labeled leukemia and details how to isolate and transplant these leukemia cells at limiting dilution into the peritoneal cavity of adult zebrafish.

قياس التردد من ورم الخلايا باستخدام الحد من نشر زرع الخلايا في التخفيف اسماك الزرد مسانج

Self-renewing cancer cells are the only cell types within a tumor that have an unlimited ability to promote tumor growth, and are thus known as ...

Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography

Contraction or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries determines the artery diameter and thereby controls flow of blood through the vessel and contributes to systemic blood pressure. The contraction process is regulated primarily by cytosolic calcium concentration ([Ca2+]cyt), which is in turn controlled by a variety of ion transporters and channels. Ion channels are common intermediates in signal transduction pathways activated by vasoactive hormones to effect vasoconstriction or vasodilation. And ion channels are often targeted by therapeutic agents either intentionally (e.g. calcium channel blockers used to induce vasodilation and lower blood pressure) or unintentionally (e.g. to induce unwanted cardiovascular side effects).
Kv7 (KCNQ) voltage-activated potassium channels have recently been implicated as important physiological and therapeutic targets for regulation of smooth muscle contraction. To elucidate the specific roles of Kv7 channels in both physiological signal transduction and in the actions of therapeutic agents, we need to study how their activity is modulated at the cellular level as well as evaluate their contribution in the context of the intact artery.
The rat mesenteric arteries provide a useful model system. The arteries can be easily dissected, cleaned of connective tissue, and used to prepare isolated arterial myocytes for patch clamp electrophysiology, or cannulated and pressurized for measurements of vasoconstrictor/vasodilator responses under relatively physiological conditions. Here we describe the methods used for both types of measurements and provide some examples of how the experimental design can be integrated to provide a clearer understanding of the roles of these ion channels in the regulation of vascular tone.

Measurements of Kv7 (KCNQ) potassium channel activity in isolated arterial myocytes (using patch clamp electrophysiological techniques) in parallel with measurements of constrictor/dilator responses (using pressure myography) can reveal important information about the roles of Kv7 channels in vascular smooth muscle physiology and pharmacology.

استكشاف الشرياني العضلات الملساء قناة البوتاسيوم Kv7 الدالة باستخدام المشبك التصحيح الكهربية وتخطيط العضل الضغط

Contraction  or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries  determines the artery diameter and thereby controls flow of ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate depends on properties intrinsic to each channel protein as well as the mechanism by which it is generated and controlled and represents an important area of current research. Information about the operational dynamics of ion channel proteins can be obtained by observing long stretches of current produced by a single molecule. Described here is a protocol for obtaining one-channel cell-attached patch-clamp current recordings for a ligand gated ion channel, the NMDA receptor, expressed heterologously in HEK293 cells or natively in cortical neurons. Also provided are instructions on how to adapt the method to other ion channels of interest by presenting the example of the mechano-sensitive channel PIEZO1. This method can provide data regarding the channel&#8217;s conductance properties and the temporal sequence of open-closed conformations that make up the channel&#8217;s activation mechanism, thus helping to understand their functions in health and disease.

Described here is a procedure for obtaining long stretches of current recording from one ion channel with the cell-attached patch-clamp technique. This method allows for observing, in real time, the pattern of open-close channel conformations that underlie the biological signal. These data inform about channel properties in undisturbed biological membranes.

قناة واحدة الخلية المرفقة تسجيل التصحيح، المشبك

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow GUVs must be modified in order to form GUVs containing functional transmembrane proteins. This article describes two dehydration-rehydration methods &#8212; electroformation and gel-assisted swelling &#8212; to form GUVs containing the voltage-gated potassium channel, KvAP. In both methods, a solution of protein-containing small unilamellar vesicles is partially dehydrated to form a stack of membranes, which is then allowed to swell in a rehydration buffer. For the electroformation method, the film is deposited on platinum electrodes so that an AC field can be applied during film rehydration. In contrast, the gel-assisted swelling method uses an agarose gel substrate to enhance film rehydration. Both methods can produce GUVs in low (e.g., 5 mM) and physiological (e.g., 100 mM) salt concentrations. The resulting GUVs are characterized via fluorescence microscopy, and the function of reconstituted channels measured using the inside-out patch-clamp configuration. While swelling in the presence of an alternating electric field (electroformation) gives a high yield of defect-free GUVs, the gel-assisted swelling method produces a more homogeneous protein distribution and requires no special equipment.

The reconstitution of the transmembrane protein, KvAP, into giant unilamellar vesicles (GUVs) is demonstrated for two dehydration-rehydration methods &#8212; electroformation, and gel-assisted swelling. In both methods, small unilamellar vesicles containing the protein are fused together to form GUVs that can then be studied by fluorescence microscopy and patch-clamp electrophysiology.

إعادة تشكيل البروتين عبر الغشاء، وايون القناة بوابات الجهد، KvAP، إلى العملاق Unilamellar الحويصلات للفحص المجهري وتصحيح الدراسات المشبك

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow ...

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

Endosomal acidification is critical for a wide range of processes, such as protein recycling and degradation, receptor desensitization, and neurotransmitter loading in synaptic vesicles. This acidification is described to be mediated by proton ATPases, coupled to ClC chloride transporters. Highly-conserved electroneutral protons transporters, the Na+/H+ exchangers (NHE) 6, 7 and 9 are also expressed in these compartments. Mutations in their genes have been linked with human cognitive and neurodegenerative diseases. Paradoxically, their roles remain elusive, as their intracellular localization has prevented detailed functional characterization. This manuscript shows a method to solve this problem. This consists of the selection of mutant cell lines, capable of surviving acute cytosolic acidification by retaining intracellular NHEs at the plasma membrane. It then depicts two complementary protocols to measure the ion selectivity and activity of these exchangers: (i) one based on intracellular pH measurements using fluorescence video microscopy, and (ii) one based on the fast kinetics of lithium uptake. Such protocols can be extrapolated to measure other non-electrogenic transporters. Furthermore, the selection procedure presented here generates cells with an intracellular retention defective phenotype. Therefore these cells will also express other vesicular membrane proteins at the plasma membrane. The experimental strategy depicted here may therefore constitute a potentially powerful tool to study other intracellular proteins that will be then expressed at the plasma membrane together with the vesicular Na+/H+ exchangers used for the selection.

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

The first part of this article shows how to select mutant cell lines expressing vesicular Na+/H+ exchangers at their plasma membrane. The second part provides protocols based on intracellular pH measurements and fast ion uptake, which are used to determine the ion selectivity and the kinetic parameters of these exchangers.

توصيف وظيفي نا<sup&gt; +</sup&gt; / H<sup&gt; +</sup&gt; المبادلات بين الخلايا من المقصورات عن طريق بروتون-مما أسفر عن مقتل اختيار للتعبير عنها في غشاء البلازما

Endosomal acidification is critical for a wide range of processes, such as protein recycling and degradation, receptor desensitization, and ...

Measurement of Extracellular Ion Fluxes Using the Ion-selective Self-referencing Microelectrode Technique

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers such as epithelia also form a barrier that separates the inside from the outside or different compartments of multicellular organisms. A key feature of these barriers is the differential distribution of ions across cell membranes or cell layers. Two properties allow this distribution: 1) membranes and epithelia display selective permeability to specific ions; 2) ions are transported through pumps across cell membranes and cell layers. These properties play crucial roles in maintaining tissue physiology and act as signaling cues after damage, during repair, or under pathological condition. The ion-selective self-referencing microelectrode allows measurements of specific fluxes of ions such as calcium, potassium or sodium at single cell and tissue levels. The microelectrode contains an ionophore cocktail which is selectively permeable to a specific ion. The internal filling solution contains a set concentration of the ion of interest. The electric potential of the microelectrode is determined by the outside concentration of the ion. As the ion concentration varies, the potential of the microelectrode changes as a function of the log of the ion activity. When moved back and forth near a source or sink of the ion (i.e. in a concentration gradient due to ion flux) the microelectrode potential fluctuates at an amplitude proportional to the ion flux/gradient. The amplifier amplifies the microelectrode signal and the output is recorded on computer. The ion flux can then be calculated by Fick&#8217;s law of diffusion using the electrode potential fluctuation, the excursion of microelectrode, and other parameters such as the specific ion mobility. In this paper, we describe in detail the methodology to measure extracellular ion fluxes using the ion-selective self-referencing microelectrode and present some representative results.

Transporters in cell membranes allow differential segregation of ions across cell membranes or cell layers and play crucial roles during tissue physiology, repair and pathology. We describe the ion-selective self-referencing microelectrode that allows the measurement of specific ion fluxes at single cells and tissues in vivo.

قياس خارج الخلية ايون تدفقاتها باستخدام ايون انتقائية مسرى مكروي تقنية الرجوع الذاتي

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but whose functions remain mysterious. Alongside growing attention on the role of chloroplasts in coordinating plant responses to stress, interest in stromules and their relationship to chloroplast signaling dynamics has increased in recent years, aided by advances in fluorescence microscopy and protein fluorophores that allow for rapid, accurate visualization of stromule dynamics. Here, we provide detailed protocols to assay stromule frequency in the epidermal chloroplasts of Nicotiana benthamiana, an excellent model system for investigating chloroplast stromule biology. We also provide methods for visualizing chloroplast stromules in vitro by extracting chloroplasts from leaves. Finally, we outline sampling strategies and statistical approaches to analyze differences in stromule frequencies in response to stimuli, such as environmental stress, chemical treatments, or gene silencing. Researchers can use these protocols as a starting point to develop new methods for innovative experiments to explore how and why chloroplasts make stromules.

Protocols to investigate the dynamics of chloroplast stromules, the stroma-filled tubules that extend from the surface of chloroplasts, are described.

تصور التردد Stromule مع مضان المجهر

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...