Name: recapitulation of an ion channel iv curve using frequency components
Uploaded: 2011-02-08T16:00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Recapitulation of an Ion Channel IV Curve Using Frequency Components at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות מספר מענק R21-01-HL094828 הוענק לד&quot;ר Poelzing.

1. הכינו פונקציה רעש אות קלט <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יצירת פונקציה רעש המכיל רכיבי התדר הרצוי. ניתן לעשות זאת על ידי תיאור רכיבי התדר הרצוי התדר ואז לחשב ההופכי Fast Fourier Transform. במחקר זה, 1-15 kHz היה בשימוש. הופך כל פורייה ו פורייה ההפוכה הופכת המתוארים במחקר זה חושבו באמצעות Matlab FFT של ופונקציות IFFT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סולם את המשרעת של הפונקציה רעש בהתאם. במחקר זה פונקציה הרעש היה בקנה מידה כזה אפס לשיא המשרעת של הפונקציה הרעש היה 50 או 100 mV. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יצירת קובץ גירוי בשיטות המתאימות תוכנה רכישת בשימוש. עבור Clampex 8, תחילה ליצור קובץ טקסט עם הכותרת המתאימה. מתחת לכותרת, להכניס את בתוספות הזמן לטאטא בודד בעמודה הראשונה. במרווחים של זמן צריך את המרווח הזמני זהה מרווח הדגימה בשימוש המדידות. עבור לטאטא כל בפרוטוקול צעד מתח להכניס את המתחים המדויק הרצוי בכל צעד זמן. זו צריכה לכלול את הפונקציה רעש. </li></ol> 2. לבצע מדידות מתח קלאמפ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יצירת פרוטוקול המדידה בתוך התוכנה הרכישה תואמת קובץ הגירוי שנוצר בעבר. ב Clampex, קיים תפריט המאפשר למשתמש לשייך קובץ גירוי עם הפרוטוקול הנוכחי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף מודל (או ביולוגי) תא לציוד המדידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצעו את הניסוי כמתוכנן. לצורך בקרה, הקפד לכלול מדידות תקופתיות שאינן כוללות כל הפונקציות רעש. </li></ol> 3. ניסוי פוסט ניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את עקומת IV הקלטה בודדת. אם ההקלטה היא במצב יציב כאשר פונקציית רעש מוחל, עקומת IV ניתן ליצור באמצעות חלק המצב היציב של ההקלטה temporally מחוץ לטווח של הפונקציה רעש. אם ההקלטה לא היה מצב יציב, הפונקציה רעש עלול להפריע החישוב של עקומת IV, אז הקלטה השנייה צריכה להתבצע ללא הפונקציה רעש הנוכחי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל שלב מתח הקלטה לחשב את פורייה מהירה להפוך החלק של הקלטה שבה הפונקציה רעש הוכנס. מערבבים את התמרת פורייה עבור כל שלב מתח amxn לתוך המטריצה, כאשר m הוא מספר תדרים FFT, ו n הוא מספר הצעדים מתח. בתצורה זו, כל שורה של המטריצה ​​מייצג את המשרעת של תדר אחד בכל הצעדים מתח בניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל תדר (כלומר, כל שורה במטריצה ​​לעיל) לתאם את השורה עם עקומת IV שנוצר 3.1 ולהקליט את מקדם המתאם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגרש מקדם המתאם תדירות לעומת לדמיין תדרים אשר מאוד לתאם עם עקומת IV. מאז רכיב DC הכלול בתוך תדר הראשון של FFT, מקדם המתאם עבור תדר זה תמיד צריך להיות&gt; 0.99. </li></ol> 4. נציג תוצאות: מדידות מתח נציג מהדק מוצגים לתא מודל ללא (איור 1A) עם פונקציה (איור 1B) רעש מוכנס לתוך פרוטוקול הצעד מתח. עקומת IV חושבה גם תא המודל (תרשים 1C). במשך כל לטאטא, את הקלטות של איור 1, FFT היה מחושב על מסגרת הזמן שבה הפונקציה רעש הוכנס (ראו מסגרת אדומה דמויות 1A, 1B). איורים 2 א ו -2 להראות FFTs מחושב עבור ההקלטות שמוצג באיור 1A ו-1B, בהתאמה. לאחר בדיקה חזותית, מרכיב DC (מסומן באדום) מופיעה לחקות את הצורה של עקומת IV. ללא הפונקציה רעש, כל התדרים מעל הבירה נראה כי אמפליטודות קרוב לאפס (איור 2 א). כאשר הפונקציה רעש מוכנס, תדרים בין 1 ל 15 קילוהרץ יש אמפליטודות בולט חזותית (תרשים 2B). איור 3 מראה את התוצאה של correlating אמפליטודות תדר בודדים על פני טווח של מתח צעדים נגד עקומת IV. איור 3A-C מציג את מקדמי המתאם כאשר הניסוי נעשה בתנאים מבוקרים (ללא פונקציה רעש) ועם אמפליטודות רעש של 50 ו - 100 mV, בהתאמה. שימו לב בכל המקרים, מרכיב DC נראה מתאם כמעט מושלם עם עקומת IV. ואכן, עבור כל הקלטות, מקדם המתאם עבור תדר זה היה יותר מ 0.99 (R = 0.9996 ± 1E-5, סטיית תקן ממוצע ±). כאשר אנו מסתכלים על איור 3A (תנאים שליטה), אין תדרים מלבד רכיב DC אשר משרעת משמעותית בקורלציה עם עקומת IV. באופן ספציפי, אף אחד התדרים האלה יש מקדמי מתאם גבוה מ -0.5. עם הכניסה של הפונקציה הנמוכה ביותר משרעת רעש (50 mV), תדרים אלו עדיין היו באותו מקדמי המתאם פחות מ -0.5. מקדמי המתאם עבורתדרים se גם לא להיות יותר מ 0.5 כאשר משרעת רעש הוגדל ל 100 mV. <img src="/files/ftp_upload/2361/2361fig1.jpg" alt="איור 1" /> . איור 1 דגם נייד הקלטות: הקלטות מהדק מתח מוצגים לתא מודל ללא (1A) עם פונקציה (1B) רעש נכלל בפרוטוקול צעד מתח. עבור הראשונה והאחרונה של 20 מילישניות לטאטא כל הפוטנציאל הוחזק על הפוטנציאל מחזיק (0 mV). כל צעד היה מתח 80 ms זמן, והפונקציה רעש הוכנס 40 מילישניות לאחר תחילת השלב. הפונקציה הרעש היה משך הזמן של 30 אלפיות והכילה תדרים בין 1 ל 15 קילוהרץ. מתח היה צעד הלוך ושוב, עד 50 mV -150 בקפיצות של 5 mV. עקומת IV עבור התא הדגם מוצג גם (1C). כדי להפוך את ההקלטות קל יותר לקריאה, רק לטאטא מדי החמישי היה כלול 1A ו-1B, אבל כל מטאטא נכללו 1C. <img src="/files/ftp_upload/2361/2361fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2 FFT של הקלטות:. FFT חושבה עבור חלק ms 30 של לטאטא כל אחד שם את הפונקציה רעש הוא להיות מוכנס (האזור מוקף בתיבת אדום דמויות 1A, 1B). איורים 2 א ו -2 להראות FFTs המחושב ללא ועם הפונקציה רעש, בהתאמה. שוב, למען הבהירות, רק FFT מן לטאטא כל החמישי הוא נכלל הדמות, אבל כל מטאטא שימשו בחישובים בעתיד. <img src="/files/ftp_upload/2361/2361fig3.jpg" alt="איור 3" /> . איור 3 תדרים מתאמים IV: התוצאות של המתאמים בין עקומת IV של הקלטת ואת משרעת של תדרים בודדים על פני טווח של צעדים מתח מוצג. איורים 1 א - 1C להראות את מקדם המתאם עבור התדרים מ 0 עד 20 קילוהרץ בתנאים שליטה, בנוכחות של 50 או 100 פונקציות רעש mV, בהתאמה. <img src="/files/ftp_upload/2361/2361fig4.jpg" alt="איור 4" /> איור 4 מחדש יצירה של עקומת IV:. עקומת IV עבור התא המודל (כמו תרשים 1C) ואת גודל של שני תדרים היו מעולף. תדירות הראשון היה רכיב DC (R = 0.995), והשני היה תדר שנבחרו באקראי עם קורלציה נמוכה (R = 0.3212). אמפליטודות תדירות היו מדורגים על משרעת בערך כמו עקומת IV.

<ol>
	<li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches.">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).</li><li>Ukomadu, C., Zhou, J., Sigworth, F. J., Agnew, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mu]l+Na++channels+expressed+transiently+in+human+embryonic+kidney+cells:+Biochemical+and+biophysical+properties.">mu]l Na+ channels expressed transiently in human embryonic kidney cells: Biochemical and biophysical properties.</a> Neuron. 8, 663-676 (1992).</li><li>Abriel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Arrhythmogenic+Mechanism+Revealed+by+a+Long-QT+Syndrome+Mutation+in+the+Cardiac+Na++Channel.">Novel Arrhythmogenic Mechanism Revealed by a Long-QT Syndrome Mutation in the Cardiac Na+ Channel.</a> Circ Res. 88, 740-745 (2001).</li><li>Giles, W. R., Imaizumi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+potassium+currents+in+rabbit+atrial+and+ventricular+cells.">Comparison of potassium currents in rabbit atrial and ventricular cells.</a> J Physiol. 405, 123-145 (1988).</li><li>Lee, K. S., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+calcium+channel+blockade+by+verapamil,+D600,+diltiazem+and+nitrendipine+in+single+dialysed+heart+cells.">Mechanism of calcium channel blockade by verapamil, D600, diltiazem and nitrendipine in single dialysed heart cells.</a> Nature. 302, 790-794 (1983).</li><li>Ozdemir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+Inhibition+of+Na/Ca+Exchange+Results+in+Increased+Cellular+Ca2++Load+Attributable+to+the+Predominance+of+Forward+Mode+Block.">Pharmacological Inhibition of Na/Ca Exchange Results in Increased Cellular Ca2+ Load Attributable to the Predominance of Forward Mode Block.</a> Circ Res. 102, 1398-1405 (2008).</li><li>Zhang, S., Zhou, Z., Gong, Q., Makielski, J. C., January, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+Block+and+Identification+of+the+Verapamil+Binding+Domain+to+HERG+Potassium+Channels.">Mechanism of Block and Identification of the Verapamil Binding Domain to HERG Potassium Channels.</a> Circ Res. 84, 989-998 (1999).</li><li>Veeraraghavan, R., Poelzing, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+underlying+increased+right+ventricular+conduction+sensitivity+to+flecainide+challenge.">Mechanisms underlying increased right ventricular conduction sensitivity to flecainide challenge.</a> Cardiovasc. Res. 77, 749-756 (2008).</li><li>Goodman, M., Art, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+feedback+by+a+potassium-selective+inward+rectifier+enhances+tuning+in+vertebrate+hair+cells.">Positive feedback by a potassium-selective inward rectifier enhances tuning in vertebrate hair cells.</a> Biophysical Journal. 71, 430-442 (1996).</li><li>Han, A., Frazier, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+channel+characterization+using+single+cell+impedance+spectroscopy.">Ion channel characterization using single cell impedance spectroscopy.</a> Lab Chip. 6, 1412-1414 (2006).</li><li>Hayashi, H., Fishman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inward+rectifier+K+-channel+kinetics+from+analysis+of+the+complex+conductance+of+Aplysia+neuronal+membrane.">Inward rectifier K+-channel kinetics from analysis of the complex conductance of Aplysia neuronal membrane.</a> Biophysical Journal. 53, 747-757 (1988).</li><li>Millonas, M. M., Hanck, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonequilibrium+response+spectroscopy+of+voltage-sensitive+ion+channel+gating.">Nonequilibrium response spectroscopy of voltage-sensitive ion channel gating.</a> Biophys. J. 74, 210-229 (1998).</li><li>Misakian, M., Kasianowicz, J., Robertson, B., Petersons, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency+response+of+alternating+currents+through+the+Staphylococcus+aureus+alpha-hemolysin+ion+channel.">Frequency response of alternating currents through the Staphylococcus aureus alpha-hemolysin ion channel.</a> Bioelectromagnetics. 22, 487-493 (2001).</li><li>Sale, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+Properties+of+hERG+1a/1b+Heteromeric+Currents+and+a+hERG+1b-Specific+Mutation+Associated+With+Long-QT+Syndrome.">Physiological Properties of hERG 1a/1b Heteromeric Currents and a hERG 1b-Specific Mutation Associated With Long-QT Syndrome.</a> Circ Res. 103, 81-95 (2008).</li><li>Blatz, A. L., Magleby, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+description+of+three+modes+of+activity+of+fast+chloride+channels+from+rat+skeletal+muscle.">Quantitative description of three modes of activity of fast chloride channels from rat skeletal muscle.</a> J Physiol. 378, 141-174 (1986).</li><li>Kuo, J. J., Lee, R. H., Zhang, L., Heckman, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+role+of+the+persistent+sodium+current+in+spike+initiation+during+slowly+rising+inputs+in+mouse+spinal+neurones.">Essential role of the persistent sodium current in spike initiation during slowly rising inputs in mouse spinal neurones.</a> The Journal of Physiology. 574, 819-834 (2006).</li><li>Thompson, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+potassium-channel+selectivity+revealed+by+Na(+)+and+Li(+)+binding+sites+within+the+KcsA+pore.">Mechanism of potassium-channel selectivity revealed by Na(+) and Li(+) binding sites within the KcsA pore.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 16, 1317-1324 (2009).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

ישנם מכשולים טכניים כיום למנוע חוקרים מדידה מרובים ערוץ סוגי יונים בו זמנית מתוך כוונה מאוחר יותר לקבוע כמה זרם לייחס לכל סוג ערוץ. בגלל מגבלה זו, תעלות יונים נלמדים בדרך כלל בנפרד באמצעות טכניקות כגון מהדק פוטנציאל מתח, זרם, פעולה. 1 כדי לחקור סוגים ערוץ יחיד, Heterologous מערכות ביטוי משמשים לעתים קרובות. 2 כאשר עובדים עם תאים מבודדים רקמות, כגון cardiomyocytes , באמצעים אחרים יש להשתמש כדי לחסום תעלות יונים שונים. לדוגמה, תעלות הנתרן יכול להיות מומת על ידי כבש מתח איטי depolarizing, 3 תעלות אשלגן פנימה לתיקון ניתן לחסום עם BaCl2 תאית, 4 ערוצי סידן ניתן לחסום באמצעות verapamil 5. שיטה אחת בשימוש כי חלקית מתגבר על מגבלה זו היא למדוד זרם זרם דרך שני סוגי ערוצים בו זמנית, ולאחר מכן לחזור על המדידה לאחר סלקטיבי חסימת סוג אחד הערוץ עם סוכן המתאים. חיסור של שתי מדידות לאחר מכן ניתן להשתמש כדי להעריך את כמות המיוחס הנוכחית לסוג ערוץ שנחסם. 6 עם זאת, ישנם שני המגבלות העיקריות על הטכניקה הזו. ראשית, חומרים כימיים לא זוהו באופן סלקטיבי יכול לחסום כל ערוץ יון, ועוד כמה תרופות בשימוש נרחב יש שאינם ספציפיים אינטראקציות עם סוגי ערוצים אחרים. 5,7 שנית, לא ניתן לקבוע מתוך הטכניקה הזו אם ערוץ אחד היא מווסתת על ידי אחר ערוץ. לדוגמה, הביטוי הטרוגנית של NAV 1.5 ו - 2.1 קיר, הוכח החדרים קביה, והוא הוצע כי קיימת מערכת יחסים סינרגטיים בין שני הערוצים, כך גבוה יותר 2.1 קיר, ביטוי החדר הימני מדכא מהירות ההולכה. 8 כיום , זה לא ניתן לאמת. במחקר זה, אנו מציעים ספקטרוסקופיה עכבה עשוי להיות כלי שימושי לחקר מרובים ערוץ יון סוגי נמדד בו זמנית. למרות שמעולם לא הציג שיטה נעשה שימוש כדי להבחין בין שני סוגי זרמים ערוץ נמדד בו זמנית, ספקטרוסקופיה עכבה שימש ללמוד מספר היבטים אחרים של תפקוד ערוץ יון. גודמן אמנות הראה באמצעות השמיעה צב שיער תאים פרוטוקולים מהדק הנוכחי יכול להיות שונה לכוון תא אל תדרים שונים, ואת תנודות בפוטנציאל הטרנסממברני בשל יחסי הגומלין בין פנימי לתיקון K + ערוץ ערוץ Ca 2 +. 9 האן פרייזר עכבה הוכיח כי ניתן למדוד בתא בודד על פני טווח רחב של תדרים (100 הרץ עד 5 MHz), והגידול עכבה נצפתה כאשר K + או Ca 2 + ערוצי נחסמו יכול להיות אמצעי פשוט לאתר לחסום ערוץ מסכי התרופה גבוהה התפוקה. 10 היאשי פישמן השתמשו מוליכות מורכבים ללמוד מאפייני הקינטית של תיקון פנימי K + ערוץ 11. קבוצות אחרות יש תדר בודד מוכנס לתוך פרוטוקול מהדק מתח של סוגי ערוצים שונים הראו כי תגובת תדר נצפתה הסכים עם התגובה הצפויה של כמה תדרים, אך לא לאחרים. 12,13 ו Millonas Hanck הציע הסיבה תדרים מסוימים לא לייצר את התגובה הצפויה היא הנוכחות של קבועי קצב מרובים במודל מרקוב. ​​12 מחקרים כגון אלה, כמו גם אחרים, הראו כי ישנם מקרים שבהם זרמים יוניים נמדד מתוך תעלות יונים תוך שימוש ספקטרוסקופיה עכבה לא מסכים עם תגובת תדר תיאורטי. זו אינה דאגה במחקר זה כי המטרה של השיטה במחקר זה היא לזהות תדרים לתאם עם משרעת הזרם העצמאי של הנחות היסוד של מעגל חשמלי הממברנה. Furtheremore, משרעת הנוכחי מחושב חלקים של הקלטות כי אין שום פונקציות רעש מוכנס לתוך אותם. מספר מחקרים אחרים גם הדגמים הנוכחי של תעלות יונים רבות בתערוכה מדינות רבות בניהול ולא כל הולכה עם קבועי קצב משלהם. 14,15,16 Thompson et al הראו כי פילטר הסלקטיביות של ערוץ KcsA יש אתרי קישור שונים עבור Na +, Li + ו K +, ואת העלויות האנרגטי של נעה מאתר אחד מחייב אחר כמו עובר יון דרך המסנן סלקטיביות היא מה שעושה ערוץ מעדיפים לנהל K + יונים דרך הנקבוביות שלה. 17 במאמר זה אנו מוכנס מגוון של תדרים (פונקציה רעש) לתוך פרוטוקול צעד מתח וחיפשתי תדרים אשר משרעת מאוד לתאם עם משרעת הזרם הכללי. מאז ראיות חזקות הוצגה מציע קבועים שיעור מספר לשחק תפקיד הולכה של יונים באמצעות בידולt ערוצים, המבוא של תדרים הקשורים בקבועים אלה קצב עלול לגרום תדרים מסוימים או להדהד מאוד לתאם עם משרעת הנוכחי, אשר לא היה אחרת. השיטה הוכיחה במחקר זה מבוצע על תא מודל, המהווה מעגל RC מקבילי אשר משמש בדרך כלל כדי לבדוק את המעגלים מהדק מתח וציוד הרכישה. זה לא צפוי כי כל התדרים מלבד הבירה היה לתאם עם גודל הנוכחי, וזה מוצג הנתונים שלנו. אנחנו גם מראים כי תוספת של הפונקציה הרעש לא גרם כל התדרים מאוד לתאם עם משרעת הנוכחי. אלה שני הממצאים הם קריטיים כי הם מראים כי ציוד המדידה פונקציה רעש לא בכוחות עצמם לגרום תדרים כל לתאם עם משרעת הנוכחי. כאשר מחקרים עתידיים לבצע מדידות באמצעות ממברנות המכילות תעלות יונים, צפוי כי, בהתאם לערוץ בשימוש, התדרים שמתאימים קבועים בשיעור במסנן סלקטיביות או אולי הנקבובית ישפיעו על תגובת התדר של ערוץ ולהשפיע אשר יש תדרים גבוהים או מתאם נמוך עם משרעת הנוכחי. מאז שיטה זו היא שיטה חדשה ללימוד תעלות יונים, ישנם מספר כיוונים מחקרים עתידיים יכולים לעקוב. ראשית, השיטה צריכה לשמש כדי לאפיין את תגובת תדר של ערוצים מבודדים ספציפיים. עבודה נוספת גם צריך לעשות כדי לכייל את התדר אמפליטודות של אמפליטודות הנוכחי. לאחר מספר ערוצי מאופיינים בנפרד, סוגי ערוצים מרובים יש למדוד בו זמנית. הטכניקה יכולה להיות גם מותאם לשימוש מהדק פעולה פוטנציאליים, מהדק הנוכחית, גירוי מחקרים בתחום. בזמן הזה היא טכניקה חדשה, זה מראה מה יכול להיות דרך רבת עוצמה כדי לבצע מדידות אלקטרו כי היו בעבר לא אפשרי לספק תובנות חדשות רבות ערך התפקיד הפיזיולוגי של תעלות יונים.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Matlab</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mathworks</td>
<td>n/a</td>
<td>Natick, MA</td>
</tr>
<tr>
<td>Clampex 8</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>Clampex 8</td>
<td>Sunnyvale, CA</td>
</tr>
<tr>
<td>Integrating Patch Clamp Amplifier</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>Axopatch 200</td>
<td>Sunnyvale, CA</td>
</tr>
<tr>
<td>Headstage</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>CV202</td>
<td>Sunnyvale, CA</td>
</tr>
<tr>
<td>16-Bit Data Acquisition System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>Digidata 1322A</td>
<td>Sunnyvale, CA</td>
</tr>
<tr>
<td>Model Cell</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>Patch 1 Model Cell</td>
<td>Sunnyvale, CA</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

recapitulation of an ion channel iv curve using frequency components

מבוא: נכון להיום, אין שיטות הוקמה כדי למדוד את מספר הערוץ סוגי יונים בו זמנית לפרק הנוכחי נמדד לחלקים לייחס כל סוג ערוץ. מחקר זה מדגים כיצד ספקטרוסקופיה עכבה יכול לשמש כדי לזהות תדרים ספציפיים מאוד לתאם עם משרעת המצב היציב הנוכחי למדוד במהלך הניסויים מהדק מתח. השיטה כוללת החדרת פונקציה רעש המכיל תדרים ספציפי לתוך פרוטוקול הצעד מתח. בעבודה המוצגת, תא המודל משמש על מנת להוכיח כי אין מתאם גבוה מוצגים על ידי המעגלים מהדק מתח, וגם כי תפקידו הרעש עצמו לא להציג את כל המתאמים גבוהים כאשר אין תעלות יונים קיימות. אימות זה הכרחי לפני הטכניקה ניתן ליישם תכשירים המכילים תעלות יונים. מטרת הפרוטוקול המוצג הינו כדי להדגים כיצד לאפיין את תגובת תדר של סוג יון ערוץ יחיד לתפקד רעש. לאחר תדרים ספציפיים זוהו סוג ערוץ בודדים, הם יכולים לשמש כדי לשחזר את המצב היציב הנוכחי מתח (IV) עקומה. תדרים מאוד לתאם עם סוג אחד של ערוץ מינימלית לתאם עם סוגי ערוצים אחרים עשויים לאחר מכן ניתן להשתמש כדי להעריך את התרומה הנוכחית של ערוץ סוגים רבים נמדד בו זמנית. שיטות: מדידות מהדק מתח בוצעו על תא באמצעות מודל מתח סטנדרטי צעד פרוטוקול (-150 עד 50 mV, 5mV צעדים). פונקציות Noise המכיל הבהירויות שווה של 1-15 קילוהרץ תדרים (אפס לשיא אמפליטודות: 50 או 100mV) הוכנסו לתוך כל שלב מתח. הרכיב האמיתי של Fast Fourier Transform (FFT) של אות פלט חושבה עם ובלי רעש עבור פוטנציאל כל צעד. העוצמה של כל תדר כפונקציה של מתח היה צעד בקורלציה עם משרעת הנוכחי על מתח המקביל. תוצאות ומסקנות: בהעדר רעש (שליטה), בסדרי גודל של כל התדרים למעט רכיב DC בקורלציה גרוע (| ר | &lt;0.5) עם עקומת IV, ואילו מרכיב DC היה מקדם המתאם עולה 0.999 במדידות כל. איכות הקשר בין תדרים בודדים עקומת IV לא השתנה כאשר פונקציה רעש נוספה פרוטוקול הצעד מתח. כמו כן, הגדלת המשרעת של הפונקציה רעש גם לא להגדיל את המתאם. מדידות בקרה להוכיח כי מהדק מתח המעגלים כשלעצמו אינו גורם תדרים מעל הרץ 0 עד מאוד לתאם עם עקומת IV היציב. כמו כן, המדידות בנוכחות פונקציה הרעש להוכיח כי הפונקציה רעש אינו גורם תדרים מעל 0 הרץ לתאם עם עקומת IV היציב כאשר אין תעלות יונים קיימות. בהתבסס על אישור זה, השיטה כעת ניתן ליישם תכשירים המכילים סוג יחיד ערוץ יון עם הכוונה של תדרים זיהוי אשר אמפליטודות לתאם במיוחד עם סוג ערוץ.

Watch this Scientific Journal Video about Recapitulation of an Ion Channel IV Curve Using Frequency Components at JoVE.com

Recapitulation of an Ion Channel IV Curve Using Frequency Components

ישנם מכשולים טכניים למדידת שטף זרם דרך תעלות יונים בו זמנית, ועל הבחנה מאוחר יותר מה החלק הנוכחי הטרנסממברני בשל כל סוג ערוץ. כדי לענות על צורך זה, שיטה זו מציגה את הדרך ליצור את עקומת IV של סוגי ערוצים בודדים באמצעות רכיבי תדר ספציפי.

סיכום של Curve ערוץ IV יון באמצעות רכיבי תדר

INTRODUCTION: Presently, there are no established methods to measure multiple ion channel types simultaneously and decompose the measured current into ...

recapitulation-of-an-ion-channel-iv-curve-using-frequency-components

Research

JoVE Journal

Biology

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

MALDI הכנה לדוגמא: שיטת אולטרה שכבה דקה

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Major Components of the Light Microscope

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

הרכיבים העיקריים של מיקרוסקופ אור

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for ...

Homemade Site Directed Mutagenesis of Whole Plasmids

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned target gene can be altered by substitution, deletion or insertion of a few bases directly into a plasmid. It works by simply amplifying the whole plasmid, in a non PCR-based thermocycling reaction. During the reaction mutagenic primers, carrying the desired mutation, are integrated into the newly synthesized plasmid. In this video tutorial we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid. The protocol works with standard reagents and is independent from commercial kits, which often are very expensive. Applying this protocol can reduce the total cost of a reaction to an eighth of what it costs using some of the commercial kits. In this video we also comment on critical steps during the process and give detailed instructions on how to design the mutagenic primers.

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. Here we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid using standard reagents.

Mutagenesis האתר ביתי בימוי של פלסמידים שלמים

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned ...

Quantifying the Frequency of Tumor-propagating Cells Using Limiting Dilution Cell Transplantation in Syngeneic Zebrafish

Self-renewing cancer cells are the only cell types within a tumor that have an unlimited ability to promote tumor growth, and are thus known as tumor-propagating cells, or tumor-initiating cells. It is thought that targeting these self-renewing cells for destruction will block tumor progression and stop relapse, greatly improving patient prognosis1. The most common way to determine the frequency of self-renewing cells within a tumor is a limiting dilution cell transplantation assay, in which tumor cells are transplanted into recipient animals at increasing doses; the proportion of animals that develop tumors is used the calculate the number of self-renewing cells within the original tumor sample2, 3. Ideally, a large number of animals would be used in each limiting dilution experiment to accurately determine the frequency of tumor-propagating cells. However, large scale experiments involving mice are costly, and most limiting dilution assays use only 10-15 mice per experiment. 
Zebrafish have gained prominence as a cancer model, in large part due to their ease of genetic manipulation and the economy by which large scale experiments can be performed. Additionally, the cancer types modeled in zebrafish have been found to closely mimic their counterpart human disease4. While it is possible to transplant tumor cells from one fish to another by sub-lethal irradiation of recipient animals, the regeneration of the immune system after 21 days often causes tumor regression5. The recent creation of syngeneic zebrafish has greatly facilitated tumor transplantation studies 6-8. Because these animals are genetically identical, transplanted tumor cells engraft robustly into recipient fish, and tumor growth can be monitored over long periods of time. Syngeneic zebrafish are ideal for limiting dilution transplantation assays in that tumor cells do not have to adapt to growth in a foreign microenvironment, which may underestimate self-renewing cell frequency9, 10. Additionally, one-cell transplants have been successfully completed using syngeneic zebrafish8 and several hundred animals can be easily and economically transplanted at one time, both of which serve to provide a more accurate estimate of self-renewing cell frequency.
Here, a method is presented for creating primary, fluorescently-labeled T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) in syngeneic zebrafish, and transplanting these tumors at limiting dilution into adult fish to determine self-renewing cell frequency. While leukemia is provided as an example, this protocol is suitable to determine the frequency of tumor-propagating cells using any cancer model in the zebrafish.

Limiting dilution cell transplantation assays are used to determine the frequency of tumor-propagating cells. This protocol describes a method for generating syngeneic zebrafish that develop fluorescently-labeled leukemia and details how to isolate and transplant these leukemia cells at limiting dilution into the peritoneal cavity of adult zebrafish.

כימות תדירות הגידול מתפשט תאים באמצעות הגבלת השתלת דילול ב Syngeneic דג הזברה

Self-renewing cancer cells are the only cell types within a tumor that have an unlimited ability to promote tumor growth, and are thus known as ...

Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography

Contraction or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries determines the artery diameter and thereby controls flow of blood through the vessel and contributes to systemic blood pressure. The contraction process is regulated primarily by cytosolic calcium concentration ([Ca2+]cyt), which is in turn controlled by a variety of ion transporters and channels. Ion channels are common intermediates in signal transduction pathways activated by vasoactive hormones to effect vasoconstriction or vasodilation. And ion channels are often targeted by therapeutic agents either intentionally (e.g. calcium channel blockers used to induce vasodilation and lower blood pressure) or unintentionally (e.g. to induce unwanted cardiovascular side effects).
Kv7 (KCNQ) voltage-activated potassium channels have recently been implicated as important physiological and therapeutic targets for regulation of smooth muscle contraction. To elucidate the specific roles of Kv7 channels in both physiological signal transduction and in the actions of therapeutic agents, we need to study how their activity is modulated at the cellular level as well as evaluate their contribution in the context of the intact artery.
The rat mesenteric arteries provide a useful model system. The arteries can be easily dissected, cleaned of connective tissue, and used to prepare isolated arterial myocytes for patch clamp electrophysiology, or cannulated and pressurized for measurements of vasoconstrictor/vasodilator responses under relatively physiological conditions. Here we describe the methods used for both types of measurements and provide some examples of how the experimental design can be integrated to provide a clearer understanding of the roles of these ion channels in the regulation of vascular tone.

Measurements of Kv7 (KCNQ) potassium channel activity in isolated arterial myocytes (using patch clamp electrophysiological techniques) in parallel with measurements of constrictor/dilator responses (using pressure myography) can reveal important information about the roles of Kv7 channels in vascular smooth muscle physiology and pharmacology.

היכרות עם פונקצית עורקי שריר חלק Kv7 אשלגן ערוץ באמצעות אלקטרופיזיולוגיה קלאמפ תיקון וMyography לחץ

Contraction  or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries  determines the artery diameter and thereby controls flow of ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate depends on properties intrinsic to each channel protein as well as the mechanism by which it is generated and controlled and represents an important area of current research. Information about the operational dynamics of ion channel proteins can be obtained by observing long stretches of current produced by a single molecule. Described here is a protocol for obtaining one-channel cell-attached patch-clamp current recordings for a ligand gated ion channel, the NMDA receptor, expressed heterologously in HEK293 cells or natively in cortical neurons. Also provided are instructions on how to adapt the method to other ion channels of interest by presenting the example of the mechano-sensitive channel PIEZO1. This method can provide data regarding the channel&#8217;s conductance properties and the temporal sequence of open-closed conformations that make up the channel&#8217;s activation mechanism, thus helping to understand their functions in health and disease.

Described here is a procedure for obtaining long stretches of current recording from one ion channel with the cell-attached patch-clamp technique. This method allows for observing, in real time, the pattern of open-close channel conformations that underlie the biological signal. These data inform about channel properties in undisturbed biological membranes.

הקלטת תיקון מהדק מצורף תא אחד ערוצים

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow GUVs must be modified in order to form GUVs containing functional transmembrane proteins. This article describes two dehydration-rehydration methods &#8212; electroformation and gel-assisted swelling &#8212; to form GUVs containing the voltage-gated potassium channel, KvAP. In both methods, a solution of protein-containing small unilamellar vesicles is partially dehydrated to form a stack of membranes, which is then allowed to swell in a rehydration buffer. For the electroformation method, the film is deposited on platinum electrodes so that an AC field can be applied during film rehydration. In contrast, the gel-assisted swelling method uses an agarose gel substrate to enhance film rehydration. Both methods can produce GUVs in low (e.g., 5 mM) and physiological (e.g., 100 mM) salt concentrations. The resulting GUVs are characterized via fluorescence microscopy, and the function of reconstituted channels measured using the inside-out patch-clamp configuration. While swelling in the presence of an alternating electric field (electroformation) gives a high yield of defect-free GUVs, the gel-assisted swelling method produces a more homogeneous protein distribution and requires no special equipment.

The reconstitution of the transmembrane protein, KvAP, into giant unilamellar vesicles (GUVs) is demonstrated for two dehydration-rehydration methods &#8212; electroformation, and gel-assisted swelling. In both methods, small unilamellar vesicles containing the protein are fused together to form GUVs that can then be studied by fluorescence microscopy and patch-clamp electrophysiology.

כינונה מחדש של חלבון טראנסממברנלי, יון ערוץ מתח מגודרת, KvAP, לענק Unilamellar שלפוחית ​​למיקרוסקופי וצמד תיקון ללימודים

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow ...

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

Endosomal acidification is critical for a wide range of processes, such as protein recycling and degradation, receptor desensitization, and neurotransmitter loading in synaptic vesicles. This acidification is described to be mediated by proton ATPases, coupled to ClC chloride transporters. Highly-conserved electroneutral protons transporters, the Na+/H+ exchangers (NHE) 6, 7 and 9 are also expressed in these compartments. Mutations in their genes have been linked with human cognitive and neurodegenerative diseases. Paradoxically, their roles remain elusive, as their intracellular localization has prevented detailed functional characterization. This manuscript shows a method to solve this problem. This consists of the selection of mutant cell lines, capable of surviving acute cytosolic acidification by retaining intracellular NHEs at the plasma membrane. It then depicts two complementary protocols to measure the ion selectivity and activity of these exchangers: (i) one based on intracellular pH measurements using fluorescence video microscopy, and (ii) one based on the fast kinetics of lithium uptake. Such protocols can be extrapolated to measure other non-electrogenic transporters. Furthermore, the selection procedure presented here generates cells with an intracellular retention defective phenotype. Therefore these cells will also express other vesicular membrane proteins at the plasma membrane. The experimental strategy depicted here may therefore constitute a potentially powerful tool to study other intracellular proteins that will be then expressed at the plasma membrane together with the vesicular Na+/H+ exchangers used for the selection.

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

The first part of this article shows how to select mutant cell lines expressing vesicular Na+/H+ exchangers at their plasma membrane. The second part provides protocols based on intracellular pH measurements and fast ion uptake, which are used to determine the ion selectivity and the kinetic parameters of these exchangers.

אפיון פונקציונלי של Na<sup&gt; +</sup&gt; / H<sup&gt; +</sup&gt; מחליפי של תאיים תאים לשימוש Proton-הרג בחירה לבטא אותם בקרום פלזמה

Endosomal acidification is critical for a wide range of processes, such as protein recycling and degradation, receptor desensitization, and ...

Measurement of Extracellular Ion Fluxes Using the Ion-selective Self-referencing Microelectrode Technique

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers such as epithelia also form a barrier that separates the inside from the outside or different compartments of multicellular organisms. A key feature of these barriers is the differential distribution of ions across cell membranes or cell layers. Two properties allow this distribution: 1) membranes and epithelia display selective permeability to specific ions; 2) ions are transported through pumps across cell membranes and cell layers. These properties play crucial roles in maintaining tissue physiology and act as signaling cues after damage, during repair, or under pathological condition. The ion-selective self-referencing microelectrode allows measurements of specific fluxes of ions such as calcium, potassium or sodium at single cell and tissue levels. The microelectrode contains an ionophore cocktail which is selectively permeable to a specific ion. The internal filling solution contains a set concentration of the ion of interest. The electric potential of the microelectrode is determined by the outside concentration of the ion. As the ion concentration varies, the potential of the microelectrode changes as a function of the log of the ion activity. When moved back and forth near a source or sink of the ion (i.e. in a concentration gradient due to ion flux) the microelectrode potential fluctuates at an amplitude proportional to the ion flux/gradient. The amplifier amplifies the microelectrode signal and the output is recorded on computer. The ion flux can then be calculated by Fick&#8217;s law of diffusion using the electrode potential fluctuation, the excursion of microelectrode, and other parameters such as the specific ion mobility. In this paper, we describe in detail the methodology to measure extracellular ion fluxes using the ion-selective self-referencing microelectrode and present some representative results.

Transporters in cell membranes allow differential segregation of ions across cell membranes or cell layers and play crucial roles during tissue physiology, repair and pathology. We describe the ion-selective self-referencing microelectrode that allows the measurement of specific ion fluxes at single cells and tissues in vivo.

מדידה של תאי יון שטפי שימוש בטכניקת microelectrode העצמית התייחסות יון סלקטיבי

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but whose functions remain mysterious. Alongside growing attention on the role of chloroplasts in coordinating plant responses to stress, interest in stromules and their relationship to chloroplast signaling dynamics has increased in recent years, aided by advances in fluorescence microscopy and protein fluorophores that allow for rapid, accurate visualization of stromule dynamics. Here, we provide detailed protocols to assay stromule frequency in the epidermal chloroplasts of Nicotiana benthamiana, an excellent model system for investigating chloroplast stromule biology. We also provide methods for visualizing chloroplast stromules in vitro by extracting chloroplasts from leaves. Finally, we outline sampling strategies and statistical approaches to analyze differences in stromule frequencies in response to stimuli, such as environmental stress, chemical treatments, or gene silencing. Researchers can use these protocols as a starting point to develop new methods for innovative experiments to explore how and why chloroplasts make stromules.

Protocols to investigate the dynamics of chloroplast stromules, the stroma-filled tubules that extend from the surface of chloroplasts, are described.

חזותי תדר Stromule עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...