Name: recapitulation of an ion channel iv curve using frequency components
Uploaded: 2011-02-08T16:00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Recapitulation of an Ion Channel IV Curve Using Frequency Components at JoVE.com

Работа выполнена при поддержке Национального института здоровья номер гранта R21-HL094828-01 награжден доктор Poelzing.

1. Подготовка Функция шума и входного сигнала <ol><li> Создать шума функции, содержащей нужные компоненты частоты. Это может быть сделано путем описания желаемого частотных составляющих в частотной области, а затем расчета обратного быстрого преобразования Фурье. В этом исследовании, 1 - 15 кГц была использована. Все преобразования Фурье и обратное преобразование Фурье, описанных в данном исследовании, были рассчитаны с использованием БПФ Matlab и IFFT функций. </li><li> Шкала амплитуда шума функции надлежащим образом. В этом исследовании шума функция масштабируется так, что от нуля до пика амплитуды шума функция была 50 или 100 мВ. </li><li> Создать стимулы файл, используя методы подходят для приобретения программного обеспечения используется. Для CLAMPEX 8, сначала создайте текстовый файл с соответствующим заголовком. Ниже заголовка, вставка времени надбавок за одним движением в первой колонке. Приращениях времени должны иметь те же временные расстояния как интервал выборки, используемые в измерениях. Для каждой развертки в напряжении протокол шаг вставить точные напряжения желаемого на каждом шаге по времени. Это должно включать шум функции. </li></ol> 2. Выполните измерения напряжения зажим <ol><li> Создание протокола измерений в приобретение программного обеспечения, совместимого с стимул файла, созданного ранее. В CLAMPEX, есть меню, которое позволяет пользователю связать стимул файл с текущего протокола. </li><li> Приложите модель (или биологическое) ячейки измерительного оборудования. </li><li> Выполните эксперимент, как запланировано. Для целей контроля, не забудьте включить периодических измерений, которые не содержат никакого шума функций. </li></ol> 3. Анализ Сообщение Эксперимент <ol><li> Рассчитать кривую IV для отдельных записи. Если запись в равновесном состоянии, когда шум применяется функция, кривая IV можно создать с помощью устойчивая часть состояния записи временно за пределами диапазона шума функции. Если запись не была в равновесном состоянии, шум функция может вмешиваться в расчет кривой IV, так что вторая запись должна производиться без шума функция присутствует. </li><li> Для каждого напряжения шаг в записи расчета быстрого преобразования Фурье часть записи, где шум функция была вставлена. Комбинат преобразование Фурье для каждого напряжения шаг в amxn матрицы, где т-число частот в БПФ, а п-число ступеней напряжения. В этой конфигурации, каждая строка матрицы представляет собой амплитуду одной частоты на всех ступеней напряжения в эксперименте. </li><li> Для каждой частоты (то есть каждая строка в приведенном выше матрицы) коррелируют ряд с кривой IV генерируется в 3,1 и записывать коэффициент корреляции. </li><li> Участок против коэффициент корреляции частоты для визуализации частот, которые сильно коррелируют с кривой IV. Так как постоянная составляющая содержится в первой частоте БПФ, коэффициент корреляции для этой частоты должна всегда быть&gt; 0,99. </li></ol> 4. Представитель Результаты: Представитель измерения напряжения зажим показаны для модели клетки без (рис. 1А) и с (рис. 1В) шум функция вставляется в напряжении протокол шаг. Кривая IV был также рассчитаны для модели клетки (рис. 1в). Для каждой развертки, в записях из рисунка 1, БПФ был рассчитан по времени кадр, где шум функция была включена (см. красную коробку на рисунках 1А, 1Б). Цифры 2А и 2В показывают БПФ рассчитаны для записи показано на рисунке 1А и 1В, соответственно. После визуального осмотра, постоянная составляющая (выделено красным) появляется, чтобы имитировать форму кривой IV. Без шума функции, все частоты выше DC-видимому, амплитуда близка к нулю (рис. 2А). Когда шум Функция вставляется, частоты от 1 до 15 кГц имеют визуально заметные амплитуды (рис. 2В). На рисунке 3 показан результат соотнесения отдельных амплитуд частот в диапазоне напряжения шаги против кривой IV. На рис.3-C показывает, коэффициенты корреляции, когда эксперимент был проведен под контролем условиях (без шума функции) и с шумом амплитуды 50 и 100 мВ, соответственно. Обратите внимание, во всех случаях, постоянная составляющая появляется соотнести почти идеально совпадает с кривой IV. Действительно, для всех записей, коэффициент корреляции для этой частоты было больше, чем 0,99 (R = 0,9996 ± 1E-5, среднее ± стандартное отклонение). Когда мы смотрим на рисунок 3А (контроль условий), Есть нет частот, кроме постоянной составляющей, амплитуда которого значительно коррелирует с кривой IV. В частности, ни одна из этих частот имеют коэффициенты корреляции больше 0,5. При вставке из самых низких функцией амплитуды шума (50 мВ), эти же частоты еще коэффициентов корреляции менее 0,5. Коэффициенты корреляции длятаковой частоты также не стал более 0,5 когда амплитуда шума был увеличен до 100 мВ. <img src="/files/ftp_upload/2361/2361fig1.jpg" alt="Рисунок 1" /> . Рисунок 1 Модель сотового Recordings: Напряжение записи зажима приведены для модели клетки без (1А) и с (1В) шума функции, включенные в протокол шагового напряжения. Для первых и последних 20 мс каждой развертки, потенциал сохранился на проведение потенциала (0 мВ). Каждый шаг был напряжением 80 мс долго, и шум функция была включена 40 мс после начала шаг. Функция шума был продолжительностью 30 мс и содержащиеся частотах от 1 до 15 кГц. Напряжение было шагнул в сторону, от -150 до +50 мВ в 5 мВ шагом. Кривая IV для модели ячейка также показано (1С). Для того, чтобы записи легче читать, только каждый пятый развертки был включен в 1А и 1В, но все это проносится были включены в 1С. <img src="/files/ftp_upload/2361/2361fig2.jpg" alt="Рисунок 2" /> Рисунок 2 БПФ Recordings. БПФ был рассчитан для 30 мс часть каждой развертки, где шум функции должен быть вставлен (площадь, ограниченная красными окно на рисунках 1А, 1Б). Цифры 2А и 2В показывают БПФ рассчитан без учета и с шумом функции, соответственно. Еще раз, для ясности, только БПФ от каждого пятого развертки включается в цифру, но все это проносится были использованы в будущих расчетах. <img src="/files/ftp_upload/2361/2361fig3.jpg" alt="Рисунок 3" /> На рис. 3 IV Частота корреляции: результаты корреляции между кривой IV от записи и амплитуды отдельных частот в диапазоне ступеней напряжения показана. Цифры 1А - 1C показывают коэффициент корреляции для частот от 0 до 20 кГц под контролем условиях и в присутствии 50 или 100 мВ функций шума, соответственно. <img src="/files/ftp_upload/2361/2361fig4.jpg" alt="Рисунок 4" /> Рисунок 4 воссоздание Кривая IV:. Кривая IV для модели клетки (так же как показано на рисунке 1C) и величины двух частотах были наложены. Первая частота была постоянная составляющая (R = 0,995), а второй был случайно выбранных частот с низкой корреляции (R = 0,3212). Частота амплитуды были сокращены примерно одинаковую амплитуду, как кривая IV.

<ol>
	<li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches.">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).</li><li>Ukomadu, C., Zhou, J., Sigworth, F. J., Agnew, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mu]l+Na++channels+expressed+transiently+in+human+embryonic+kidney+cells:+Biochemical+and+biophysical+properties.">mu]l Na+ channels expressed transiently in human embryonic kidney cells: Biochemical and biophysical properties.</a> Neuron. 8, 663-676 (1992).</li><li>Abriel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Arrhythmogenic+Mechanism+Revealed+by+a+Long-QT+Syndrome+Mutation+in+the+Cardiac+Na++Channel.">Novel Arrhythmogenic Mechanism Revealed by a Long-QT Syndrome Mutation in the Cardiac Na+ Channel.</a> Circ Res. 88, 740-745 (2001).</li><li>Giles, W. R., Imaizumi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+potassium+currents+in+rabbit+atrial+and+ventricular+cells.">Comparison of potassium currents in rabbit atrial and ventricular cells.</a> J Physiol. 405, 123-145 (1988).</li><li>Lee, K. S., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+calcium+channel+blockade+by+verapamil,+D600,+diltiazem+and+nitrendipine+in+single+dialysed+heart+cells.">Mechanism of calcium channel blockade by verapamil, D600, diltiazem and nitrendipine in single dialysed heart cells.</a> Nature. 302, 790-794 (1983).</li><li>Ozdemir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+Inhibition+of+Na/Ca+Exchange+Results+in+Increased+Cellular+Ca2++Load+Attributable+to+the+Predominance+of+Forward+Mode+Block.">Pharmacological Inhibition of Na/Ca Exchange Results in Increased Cellular Ca2+ Load Attributable to the Predominance of Forward Mode Block.</a> Circ Res. 102, 1398-1405 (2008).</li><li>Zhang, S., Zhou, Z., Gong, Q., Makielski, J. C., January, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+Block+and+Identification+of+the+Verapamil+Binding+Domain+to+HERG+Potassium+Channels.">Mechanism of Block and Identification of the Verapamil Binding Domain to HERG Potassium Channels.</a> Circ Res. 84, 989-998 (1999).</li><li>Veeraraghavan, R., Poelzing, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+underlying+increased+right+ventricular+conduction+sensitivity+to+flecainide+challenge.">Mechanisms underlying increased right ventricular conduction sensitivity to flecainide challenge.</a> Cardiovasc. Res. 77, 749-756 (2008).</li><li>Goodman, M., Art, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+feedback+by+a+potassium-selective+inward+rectifier+enhances+tuning+in+vertebrate+hair+cells.">Positive feedback by a potassium-selective inward rectifier enhances tuning in vertebrate hair cells.</a> Biophysical Journal. 71, 430-442 (1996).</li><li>Han, A., Frazier, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+channel+characterization+using+single+cell+impedance+spectroscopy.">Ion channel characterization using single cell impedance spectroscopy.</a> Lab Chip. 6, 1412-1414 (2006).</li><li>Hayashi, H., Fishman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inward+rectifier+K+-channel+kinetics+from+analysis+of+the+complex+conductance+of+Aplysia+neuronal+membrane.">Inward rectifier K+-channel kinetics from analysis of the complex conductance of Aplysia neuronal membrane.</a> Biophysical Journal. 53, 747-757 (1988).</li><li>Millonas, M. M., Hanck, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonequilibrium+response+spectroscopy+of+voltage-sensitive+ion+channel+gating.">Nonequilibrium response spectroscopy of voltage-sensitive ion channel gating.</a> Biophys. J. 74, 210-229 (1998).</li><li>Misakian, M., Kasianowicz, J., Robertson, B., Petersons, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency+response+of+alternating+currents+through+the+Staphylococcus+aureus+alpha-hemolysin+ion+channel.">Frequency response of alternating currents through the Staphylococcus aureus alpha-hemolysin ion channel.</a> Bioelectromagnetics. 22, 487-493 (2001).</li><li>Sale, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+Properties+of+hERG+1a/1b+Heteromeric+Currents+and+a+hERG+1b-Specific+Mutation+Associated+With+Long-QT+Syndrome.">Physiological Properties of hERG 1a/1b Heteromeric Currents and a hERG 1b-Specific Mutation Associated With Long-QT Syndrome.</a> Circ Res. 103, 81-95 (2008).</li><li>Blatz, A. L., Magleby, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+description+of+three+modes+of+activity+of+fast+chloride+channels+from+rat+skeletal+muscle.">Quantitative description of three modes of activity of fast chloride channels from rat skeletal muscle.</a> J Physiol. 378, 141-174 (1986).</li><li>Kuo, J. J., Lee, R. H., Zhang, L., Heckman, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+role+of+the+persistent+sodium+current+in+spike+initiation+during+slowly+rising+inputs+in+mouse+spinal+neurones.">Essential role of the persistent sodium current in spike initiation during slowly rising inputs in mouse spinal neurones.</a> The Journal of Physiology. 574, 819-834 (2006).</li><li>Thompson, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+potassium-channel+selectivity+revealed+by+Na(+)+and+Li(+)+binding+sites+within+the+KcsA+pore.">Mechanism of potassium-channel selectivity revealed by Na(+) and Li(+) binding sites within the KcsA pore.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 16, 1317-1324 (2009).</li></ol>

Нет конфликта интересов объявлены.

Есть технические препятствия, которые в настоящее время предотвратить исследователей из измерения различных типов ионных каналов одновременно с намерением последующего определения того, сколько тока должны быть отнесены к каждому каналу типа. Из-за этого ограничения, ионные каналы обычно изучаются по отдельности, используя методы, такие как напряжение, ток, и потенциал действия зажима. 1 Для изучения отдельных типов каналов, гетерологичных выражение системы часто используются. 2 При работе с клетки, выделенные из тканей, таких как кардиомиоциты , другие средства должны быть использованы для блокирования различных ионных каналов. Например, натриевые каналы могут быть инактивируется медленным деполяризующего напряжения рампы, 3 внутрь исправления калиевых каналов может быть заблокирован с внеклеточной BaCl2, 4 и кальциевые каналы могут блокироваться по верапамил 5. Один метод, который частично преодолевает это ограничение для измерения тока потока по двум каналам одновременно типов, а затем повторите измерение после выборочной блокировки один канал типа с помощью соответствующего средства. Вычитание двух измерений могут быть использованы для оценки количества тока связано с каналом типа, который был заблокирован. 6 Тем не менее, Есть два основных ограничения для этой техники. Во-первых, химические вещества не были выявлены, которая может выборочно блокировать друг ионного канала, и некоторые широко используемые препараты неспецифического взаимодействия с другими типами каналов. 5,7 Во-вторых, она не может быть определена по этой технике ли один канал модулируется другим канала. Например, гетерогенный выражение NaV 1,5 и 2,1 Кир был показан в желудочки морских свиней, и было высказано предположение, что синергетический связь существует между двумя каналами, например, что более высокие Кир 2,1 выражение в правый желудочек угнетает проводимость скорости. 8 настоящее , это не может быть проверена. В этом исследовании мы предполагаем, что импедансной спектроскопии может быть полезным инструментом для изучения нескольких типов ионных каналов измеряются одновременно. Хотя метод, представленный никогда не была использована, чтобы выделять течения из двух типов каналов измеряются одновременно, импедансной спектроскопии был использован для исследования и ряд других аспектов функции ионного канала. Гудман и искусства показали использовании черепахи слуховые волосковые клетки, что нынешние протоколы зажим может быть изменен, чтобы настроить ячейку на разные частоты, и колебания в трансмембранного потенциала связано с взаимодействием между внутренним исправления K + каналов и Са 2 + канал. 9 Хана и Фрейзер показали, что сопротивление может быть измерена в одной ячейке в широком диапазоне частот (100 Гц до 5 МГц), а также увеличение сопротивления наблюдается при K + или Са 2 + каналы были заблокированы, могут быть простыми средствами обнаружить канал блока в высоких экраны наркотиков пропускную 10. Хаяси и Фишман использовали комплексной проводимости для изучения кинетических свойств внутреннего исправления K + канала. 11 Другие группы вставили одной частоты в напряжение протокол зажим различных типов каналов и показали, что наблюдается частотная согласился с ожидаемой реакции на некоторые частоты, но не другие. 12,13 Millonas и Hanck предложил причине некоторые частоты не дали ожидаемую реакцию, является наличие нескольких констант скоростей в модели Маркова. 12 Исследования, такие как эти, а также другие, показали, что Есть случаи, когда ионные токи измеряется от ионных каналов при использовании импедансной спектроскопии не согласны с теоретической АЧХ. Это не имеет значения в данном исследовании, потому что цель метода в данном исследовании является определение частот, которые коррелируют с амплитудой тока зависят от исходных предположений мембраны электрической цепи. Furtheremore, амплитуда тока рассчитывается по части записи, которые не имеют никакого шума функции вставляются в них. Ряд других исследований также существующие модели многочисленных ионных каналов выставке многочисленных государств проводить и без проведения всех со своими константами скорости. 14,15,16 Томпсон и др. показали, что селективность фильтра канала КГГА имеет разные сайты связывания Na +, Li + и K +, и энергичная расходов на переезд из одного связывающего участка к другому, как ион проходит через избирательность фильтра является то, что делает канал преимущественно поведения ионов К + через ее поры. 17 В данной работе мы вставили диапазоне частот (шум функции) в напряжение протокол шаг и посмотрел на частоты, амплитуда которых сильно коррелируют с общей амплитудой тока. Так как сильное доказательство было представлено предлагая несколько констант скоростей играть роль в проводимости ионов через дифференциальноет каналов, внедрение частот, связанных с этими константами скорости может вызвать определенные частоты в резонанс или в значительной степени коррелирует с амплитудой тока, которые не имели бы. Техника показала в этом исследовании проводится на клеточную модель, которая является параллельной RC-цепь, которая обычно используется для проверки напряжения схемы зажим и приобретение оборудования. Не ожидается, что любой, кроме частот DC будет коррелировать с текущей величины, и это показано в наших данных. Также показано, что добавление шума функция не вызывает никаких частот высоко коррелирует с амплитудой тока. Эти два выводы имеют важное значение, потому что они показывают, что измерительное оборудование и шума функции сами по себе не вызывает никаких частот коррелирует с амплитудой тока. При дальнейших исследованиях производить измерения с использованием мембран содержащих ионные каналы, ожидается, что в зависимости от используемого канала, частоты, соответствующие константы скорости в фильтре избирательность или, возможно, пора будет влиять на частотную характеристику канала и повлиять на какие частоты имеют высокую или низкой корреляции с амплитудой тока. Поскольку этот метод является новой техники для изучения ионных каналов, Есть ряд направлений будущих исследований могли бы следовать. Во-первых, техника должна быть использована для характеристики частотной характеристики конкретных изолированных каналов. Дополнительная работа также должна быть сделана для калибровки частоты амплитуды к текущей амплитуды. После нескольких каналов характеризуются индивидуально, несколько типов канал должен быть измерены одновременно. Метод может быть также адаптирован для использования в потенциал действия зажим, токовые клещи, и полевые исследования стимуляции. Хотя это и новая техника, это показывает, что может быть мощным способом сделать электрофизиологических измерений, которые ранее были невозможны и дать ценную-новому взглянуть на физиологической роли ионных каналов.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Matlab</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mathworks</td>
<td>n/a</td>
<td>Natick, MA</td>
</tr>
<tr>
<td>Clampex 8</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>Clampex 8</td>
<td>Sunnyvale, CA</td>
</tr>
<tr>
<td>Integrating Patch Clamp Amplifier</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>Axopatch 200</td>
<td>Sunnyvale, CA</td>
</tr>
<tr>
<td>Headstage</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>CV202</td>
<td>Sunnyvale, CA</td>
</tr>
<tr>
<td>16-Bit Data Acquisition System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>Digidata 1322A</td>
<td>Sunnyvale, CA</td>
</tr>
<tr>
<td>Model Cell</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>Patch 1 Model Cell</td>
<td>Sunnyvale, CA</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

recapitulation of an ion channel iv curve using frequency components

INTRODUCTION: Presently, there are no established methods to measure multiple ion channel types simultaneously and decompose the measured current into portions attributable to each channel type. This study demonstrates how impedance spectroscopy may be used to identify specific frequencies that highly correlate with the steady state current amplitude measured during voltage clamp experiments. The method involves inserting a noise function containing specific frequencies into the voltage step protocol. In the work presented, a model cell is used to demonstrate that no high correlations are introduced by the voltage clamp circuitry, and also that the noise function itself does not introduce any high correlations when no ion channels are present. This validation is necessary before the technique can be applied to preparations containing ion channels. The purpose of the protocol presented is to demonstrate how to characterize the frequency response of a single ion channel type to a noise function. Once specific frequencies have been identified in an individual channel type, they can be used to reproduce the steady state current voltage (IV) curve. Frequencies that highly correlate with one channel type and minimally correlate with other channel types may then be used to estimate the current contribution of multiple channel types measured simultaneously.
METHODS: Voltage clamp measurements were performed on a model cell using a standard voltage step protocol (-150 to +50 mV, 5mV steps). Noise functions containing equal magnitudes of 1-15 kHz frequencies (zero to peak amplitudes: 50 or 100mV) were inserted into each voltage step. The real component of the Fast Fourier transform (FFT) of the output signal was calculated with and without noise for each step potential. The magnitude of each frequency as a function of voltage step was correlated with the current amplitude at the corresponding voltages.
RESULTS AND CONCLUSIONS: In the absence of noise (control), magnitudes of all frequencies except the DC component correlated poorly (|R|&lt;0.5) with the IV curve, whereas the DC component had a correlation coefficient greater than 0.999 in all measurements. The quality of correlation between individual frequencies and the IV curve did not change when a noise function was added to the voltage step protocol. Likewise, increasing the amplitude of the noise function also did not increase the correlation. Control measurements demonstrate that the voltage clamp circuitry by itself does not cause any frequencies above 0 Hz to highly correlate with the steady-state IV curve. Likewise, measurements in the presence of the noise function demonstrate that the noise function does not cause any frequencies above 0 Hz to correlate with the steady-state IV curve when no ion channels are present. Based on this verification, the method can now be applied to preparations containing a single ion channel type with the intent of identifying frequencies whose amplitudes correlate specifically with that channel type.

Watch this Scientific Journal Video about Recapitulation of an Ion Channel IV Curve Using Frequency Components at JoVE.com

Recapitulation of an Ion Channel IV Curve Using Frequency Components

Есть технические препятствия для измерения тока потока через несколько ионных каналов одновременно, а затем и взыскательных, какая часть трансмембранного тока из-за каждого канала типа. Чтобы удовлетворить эту потребность, этот метод представляет собой способ создания кривой IV отдельных видов канал с помощью конкретных частотных составляющих.

Повторение ионный канал Кривая IV Использование частотных составляющих

INTRODUCTION: Presently, there are no established methods to measure multiple ion channel types simultaneously and decompose the measured current into ...

recapitulation-of-an-ion-channel-iv-curve-using-frequency-components

Research

JoVE Journal

Biology

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

MALDI пробоподготовки: ультра тонкий слой Метод

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Major Components of the Light Microscope

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

Основные компоненты светового микроскопа

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for ...

Homemade Site Directed Mutagenesis of Whole Plasmids

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned target gene can be altered by substitution, deletion or insertion of a few bases directly into a plasmid. It works by simply amplifying the whole plasmid, in a non PCR-based thermocycling reaction. During the reaction mutagenic primers, carrying the desired mutation, are integrated into the newly synthesized plasmid. In this video tutorial we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid. The protocol works with standard reagents and is independent from commercial kits, which often are very expensive. Applying this protocol can reduce the total cost of a reaction to an eighth of what it costs using some of the commercial kits. In this video we also comment on critical steps during the process and give detailed instructions on how to design the mutagenic primers.

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. Here we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid using standard reagents.

Домашний сайт направленного мутагенеза Всего Плазмиды

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned ...

Quantifying the Frequency of Tumor-propagating Cells Using Limiting Dilution Cell Transplantation in Syngeneic Zebrafish

Self-renewing cancer cells are the only cell types within a tumor that have an unlimited ability to promote tumor growth, and are thus known as tumor-propagating cells, or tumor-initiating cells. It is thought that targeting these self-renewing cells for destruction will block tumor progression and stop relapse, greatly improving patient prognosis1. The most common way to determine the frequency of self-renewing cells within a tumor is a limiting dilution cell transplantation assay, in which tumor cells are transplanted into recipient animals at increasing doses; the proportion of animals that develop tumors is used the calculate the number of self-renewing cells within the original tumor sample2, 3. Ideally, a large number of animals would be used in each limiting dilution experiment to accurately determine the frequency of tumor-propagating cells. However, large scale experiments involving mice are costly, and most limiting dilution assays use only 10-15 mice per experiment. 
Zebrafish have gained prominence as a cancer model, in large part due to their ease of genetic manipulation and the economy by which large scale experiments can be performed. Additionally, the cancer types modeled in zebrafish have been found to closely mimic their counterpart human disease4. While it is possible to transplant tumor cells from one fish to another by sub-lethal irradiation of recipient animals, the regeneration of the immune system after 21 days often causes tumor regression5. The recent creation of syngeneic zebrafish has greatly facilitated tumor transplantation studies 6-8. Because these animals are genetically identical, transplanted tumor cells engraft robustly into recipient fish, and tumor growth can be monitored over long periods of time. Syngeneic zebrafish are ideal for limiting dilution transplantation assays in that tumor cells do not have to adapt to growth in a foreign microenvironment, which may underestimate self-renewing cell frequency9, 10. Additionally, one-cell transplants have been successfully completed using syngeneic zebrafish8 and several hundred animals can be easily and economically transplanted at one time, both of which serve to provide a more accurate estimate of self-renewing cell frequency.
Here, a method is presented for creating primary, fluorescently-labeled T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) in syngeneic zebrafish, and transplanting these tumors at limiting dilution into adult fish to determine self-renewing cell frequency. While leukemia is provided as an example, this protocol is suitable to determine the frequency of tumor-propagating cells using any cancer model in the zebrafish.

Limiting dilution cell transplantation assays are used to determine the frequency of tumor-propagating cells. This protocol describes a method for generating syngeneic zebrafish that develop fluorescently-labeled leukemia and details how to isolate and transplant these leukemia cells at limiting dilution into the peritoneal cavity of adult zebrafish.

Количественная Частота опухолей, распространяющихся ячеек с использованием Ограничение трансплантации Разбавление сотовый в сингенных данио рерио

Self-renewing cancer cells are the only cell types within a tumor that have an unlimited ability to promote tumor growth, and are thus known as ...

Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography

Contraction or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries determines the artery diameter and thereby controls flow of blood through the vessel and contributes to systemic blood pressure. The contraction process is regulated primarily by cytosolic calcium concentration ([Ca2+]cyt), which is in turn controlled by a variety of ion transporters and channels. Ion channels are common intermediates in signal transduction pathways activated by vasoactive hormones to effect vasoconstriction or vasodilation. And ion channels are often targeted by therapeutic agents either intentionally (e.g. calcium channel blockers used to induce vasodilation and lower blood pressure) or unintentionally (e.g. to induce unwanted cardiovascular side effects).
Kv7 (KCNQ) voltage-activated potassium channels have recently been implicated as important physiological and therapeutic targets for regulation of smooth muscle contraction. To elucidate the specific roles of Kv7 channels in both physiological signal transduction and in the actions of therapeutic agents, we need to study how their activity is modulated at the cellular level as well as evaluate their contribution in the context of the intact artery.
The rat mesenteric arteries provide a useful model system. The arteries can be easily dissected, cleaned of connective tissue, and used to prepare isolated arterial myocytes for patch clamp electrophysiology, or cannulated and pressurized for measurements of vasoconstrictor/vasodilator responses under relatively physiological conditions. Here we describe the methods used for both types of measurements and provide some examples of how the experimental design can be integrated to provide a clearer understanding of the roles of these ion channels in the regulation of vascular tone.

Measurements of Kv7 (KCNQ) potassium channel activity in isolated arterial myocytes (using patch clamp electrophysiological techniques) in parallel with measurements of constrictor/dilator responses (using pressure myography) can reveal important information about the roles of Kv7 channels in vascular smooth muscle physiology and pharmacology.

Изучение артериальной гладких мышц KV7 калиевых каналов функцию с помощью Patch Clamp электрофизиологии и давления Миография

Contraction  or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries  determines the artery diameter and thereby controls flow of ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate depends on properties intrinsic to each channel protein as well as the mechanism by which it is generated and controlled and represents an important area of current research. Information about the operational dynamics of ion channel proteins can be obtained by observing long stretches of current produced by a single molecule. Described here is a protocol for obtaining one-channel cell-attached patch-clamp current recordings for a ligand gated ion channel, the NMDA receptor, expressed heterologously in HEK293 cells or natively in cortical neurons. Also provided are instructions on how to adapt the method to other ion channels of interest by presenting the example of the mechano-sensitive channel PIEZO1. This method can provide data regarding the channel&#8217;s conductance properties and the temporal sequence of open-closed conformations that make up the channel&#8217;s activation mechanism, thus helping to understand their functions in health and disease.

Described here is a procedure for obtaining long stretches of current recording from one ion channel with the cell-attached patch-clamp technique. This method allows for observing, in real time, the pattern of open-close channel conformations that underlie the biological signal. These data inform about channel properties in undisturbed biological membranes.

Один канал сотового прилагается патч-зажим записи

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow GUVs must be modified in order to form GUVs containing functional transmembrane proteins. This article describes two dehydration-rehydration methods &#8212; electroformation and gel-assisted swelling &#8212; to form GUVs containing the voltage-gated potassium channel, KvAP. In both methods, a solution of protein-containing small unilamellar vesicles is partially dehydrated to form a stack of membranes, which is then allowed to swell in a rehydration buffer. For the electroformation method, the film is deposited on platinum electrodes so that an AC field can be applied during film rehydration. In contrast, the gel-assisted swelling method uses an agarose gel substrate to enhance film rehydration. Both methods can produce GUVs in low (e.g., 5 mM) and physiological (e.g., 100 mM) salt concentrations. The resulting GUVs are characterized via fluorescence microscopy, and the function of reconstituted channels measured using the inside-out patch-clamp configuration. While swelling in the presence of an alternating electric field (electroformation) gives a high yield of defect-free GUVs, the gel-assisted swelling method produces a more homogeneous protein distribution and requires no special equipment.

The reconstitution of the transmembrane protein, KvAP, into giant unilamellar vesicles (GUVs) is demonstrated for two dehydration-rehydration methods &#8212; electroformation, and gel-assisted swelling. In both methods, small unilamellar vesicles containing the protein are fused together to form GUVs that can then be studied by fluorescence microscopy and patch-clamp electrophysiology.

Восстановление трансмембранный белок, напряжения закрытого ионного канала, KvAP, в гигантском однослойные везикулы для микроскопии и локальной фиксации исследований

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow ...

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

Endosomal acidification is critical for a wide range of processes, such as protein recycling and degradation, receptor desensitization, and neurotransmitter loading in synaptic vesicles. This acidification is described to be mediated by proton ATPases, coupled to ClC chloride transporters. Highly-conserved electroneutral protons transporters, the Na+/H+ exchangers (NHE) 6, 7 and 9 are also expressed in these compartments. Mutations in their genes have been linked with human cognitive and neurodegenerative diseases. Paradoxically, their roles remain elusive, as their intracellular localization has prevented detailed functional characterization. This manuscript shows a method to solve this problem. This consists of the selection of mutant cell lines, capable of surviving acute cytosolic acidification by retaining intracellular NHEs at the plasma membrane. It then depicts two complementary protocols to measure the ion selectivity and activity of these exchangers: (i) one based on intracellular pH measurements using fluorescence video microscopy, and (ii) one based on the fast kinetics of lithium uptake. Such protocols can be extrapolated to measure other non-electrogenic transporters. Furthermore, the selection procedure presented here generates cells with an intracellular retention defective phenotype. Therefore these cells will also express other vesicular membrane proteins at the plasma membrane. The experimental strategy depicted here may therefore constitute a potentially powerful tool to study other intracellular proteins that will be then expressed at the plasma membrane together with the vesicular Na+/H+ exchangers used for the selection.

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

The first part of this article shows how to select mutant cell lines expressing vesicular Na+/H+ exchangers at their plasma membrane. The second part provides protocols based on intracellular pH measurements and fast ion uptake, which are used to determine the ion selectivity and the kinetic parameters of these exchangers.

Функциональная характеристика Na<sup&gt; +</sup&gt; / H<sup&gt; +</sup&gt; Теплообменники внутриклеточных отсеках с помощью Протон-убивает Выбор выразить их в плазматической мембране

Endosomal acidification is critical for a wide range of processes, such as protein recycling and degradation, receptor desensitization, and ...

Measurement of Extracellular Ion Fluxes Using the Ion-selective Self-referencing Microelectrode Technique

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers such as epithelia also form a barrier that separates the inside from the outside or different compartments of multicellular organisms. A key feature of these barriers is the differential distribution of ions across cell membranes or cell layers. Two properties allow this distribution: 1) membranes and epithelia display selective permeability to specific ions; 2) ions are transported through pumps across cell membranes and cell layers. These properties play crucial roles in maintaining tissue physiology and act as signaling cues after damage, during repair, or under pathological condition. The ion-selective self-referencing microelectrode allows measurements of specific fluxes of ions such as calcium, potassium or sodium at single cell and tissue levels. The microelectrode contains an ionophore cocktail which is selectively permeable to a specific ion. The internal filling solution contains a set concentration of the ion of interest. The electric potential of the microelectrode is determined by the outside concentration of the ion. As the ion concentration varies, the potential of the microelectrode changes as a function of the log of the ion activity. When moved back and forth near a source or sink of the ion (i.e. in a concentration gradient due to ion flux) the microelectrode potential fluctuates at an amplitude proportional to the ion flux/gradient. The amplifier amplifies the microelectrode signal and the output is recorded on computer. The ion flux can then be calculated by Fick&#8217;s law of diffusion using the electrode potential fluctuation, the excursion of microelectrode, and other parameters such as the specific ion mobility. In this paper, we describe in detail the methodology to measure extracellular ion fluxes using the ion-selective self-referencing microelectrode and present some representative results.

Transporters in cell membranes allow differential segregation of ions across cell membranes or cell layers and play crucial roles during tissue physiology, repair and pathology. We describe the ion-selective self-referencing microelectrode that allows the measurement of specific ion fluxes at single cells and tissues in vivo.

Измерение внеклеточного ионных потоков, используя ион-селективный автореферентных Микроэлектродные Техника

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but whose functions remain mysterious. Alongside growing attention on the role of chloroplasts in coordinating plant responses to stress, interest in stromules and their relationship to chloroplast signaling dynamics has increased in recent years, aided by advances in fluorescence microscopy and protein fluorophores that allow for rapid, accurate visualization of stromule dynamics. Here, we provide detailed protocols to assay stromule frequency in the epidermal chloroplasts of Nicotiana benthamiana, an excellent model system for investigating chloroplast stromule biology. We also provide methods for visualizing chloroplast stromules in vitro by extracting chloroplasts from leaves. Finally, we outline sampling strategies and statistical approaches to analyze differences in stromule frequencies in response to stimuli, such as environmental stress, chemical treatments, or gene silencing. Researchers can use these protocols as a starting point to develop new methods for innovative experiments to explore how and why chloroplasts make stromules.

Protocols to investigate the dynamics of chloroplast stromules, the stroma-filled tubules that extend from the surface of chloroplasts, are described.

Визуальное стромул Частота с флуоресцентной микроскопией

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...