Name: labeling f-actin barbed ends with rhodamine-actin in permeabilized neuronal growth cones
Uploaded: 2011-03-17T11:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Labeling F-actin Barbed Ends with Rhodamine-actin in Permeabilized Neuronal Growth Cones at JoVE.com

המחברים מודים לד&quot;ר ג&#39;יימס Bamburg ואנשי המעבדה שלו לשיתוף פעולה במחקרים אלה. עבודה זו מומנה על ידי מענקים NIH HD19950, EY07133 ועל ידי תרומות של קרן רפואית מינסוטה.

עבור תיוג rhodamine-אקטין, הנוירונים תרבותי על coverslips זכוכית ממוקם בתחתית צלחות פלסטיק 35 מ&quot;מ, או מודבק על coverslips לתוך מנות &quot;וידאו&quot;. 1. הכנת Coverslips או מנות &quot;וידאו&quot; <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סוגי נוירונים ?...

<ol>
	<li>Lowery, L. A., Van Vactor, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+trip+of+the+tip:+Understanding+the+growth+cone+machinery.">The trip of the tip: Understanding the growth cone machinery.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 332-343 (2009).</li><li>Letourneau, P., Squire, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+Pathfinding:+Extracellular+Matrix+Role.">Axonal Pathfinding: Extracellular Matrix Role.</a> Encyclopedia of Neuroscience. , 1139-1145 (2008).</li><li>Kalil, K., Dent, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Touch+and+go:+Guidance+cues+signal+to+the+growth+cone+cytoskeleton.">Touch and go: Guidance cues signal to the growth cone cytoskeleton.</a> Curr Opin Neurobio. 15, 521-526 (2005).</li><li>Dent, E. W., Gertler, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeletal+dynamics+and+transport+in+growth+cone+motility+and+axon+guidance.">Cytoskeletal dynamics and transport in growth cone motility and axon guidance.</a> Neuron. 40, 209-227 (2003).</li><li>Pak, C. W., Flynn, K. C., Bamburg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin-binding+proteins+take+the+reins+in+growth+cones.">Actin-binding proteins take the reins in growth cones.</a> Nat Rev Neurosci. 9, 136-147 (2008).</li><li>Guan, K. L., Rao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+mechanisms+mediating+neuronal+responses+to+guidance+cues.">Signaling mechanisms mediating neuronal responses to guidance cues.</a> Nat Rev Neurosci. 4, 941-956 (2003).</li><li>Gallo, G., Letourneau, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+growth+cone+actin+filaments+by+guidance+cues.">Regulation of growth cone actin filaments by guidance cues.</a> J. Neurobiology. 58, 92-102 (2004).</li><li>Fass, J., Gehler, S., Sarmiere, P., Letourneau, P., Bamburg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulating+filopodial+dynamics+through+actin-depolymerizing+factor/cofilin.">Regulating filopodial dynamics through actin-depolymerizing factor/cofilin.</a> Anat Sci Inter. 79, 173-183 (2004).</li><li>Bernstein, B. W., Bamburg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADF/cofilin:+A+functional+node+in+cell+biology.">ADF/cofilin: A functional node in cell biology.</a> Trends Cell Biol. 20, 187-195 (2010).</li><li>Marsick, B. M., Flynn, K. C., Santiago, M., Bamburg, J. R., Letourneau, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+ADF/cofilin+mediates+attractive+growth+cone+turning+toward+nerve+growth+factor+and+netrin-1.">Activation of ADF/cofilin mediates attractive growth cone turning toward nerve growth factor and netrin-1.</a> Dev Neurobiol. 70, 565-588 (2010).</li><li>Symons, M. H., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+actin+polymerization+in+live+and+permeabilized+fibroblasts.">Control of actin polymerization in live and permeabilized fibroblasts.</a> J Cell Biol. 114, 503-513 (1991).</li><li>Chan, A. Y., Raft, S., Bailly, M., Wyckoff, J. B., Segall, J. E., Condeelis, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGF+stimulates+an+increase+in+actin+nucleation+and+filament+number+at+the+leading+edge+of+the+lamellipod+in+mammary+adenocarcinoma+cells.">EGF stimulates an increase in actin nucleation and filament number at the leading edge of the lamellipod in mammary adenocarcinoma cells.</a> J Cell Sci. 111, 199-211 (1998).</li></ol>

השיטות שהוצגו כאן לאפשר ברזולוציה של זמן ומרחב של מרכיבים תאיים המעורבים בשיפוץ הדינמי של cytoskeleton אקטין בשוליים מובילה של נודדות קונוסים צמיחה. הפעולה של מולקולות attractant, כמו NGF או netrin, במהירות כדי לעורר פילמור אקטין נימה מתגלה גידול מקומי מסתיים אקטין תיל, נוצר על ידי ...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>18x18 mm coverslip</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gold Seal</td>
<td>3305</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>35mm Petri dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Falcon</td>
<td>351008</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Aquarium cement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>DAP 100% silicone aquarium sealant</td>
<td>Any hardware store</td>
</tr>
<tr>
<td>Poly-D-lysine (mw &gt; 300,000)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P1024</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Natural mouse laminin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>23017-015</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L1 CAM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>R &amp; D systems</td>
<td>777-NC</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Alexa-fluor 350 phalloidin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen (Molecular Probes)</td>
<td>A22281</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rhodamine non-muscle actin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cytoskeleton, Inc.</td>
<td>APHR-A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>F12 Culture medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen (Gibco)</td>
<td>21700-075</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>B27</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen (Gibco)</td>
<td>17504-044</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Slowfade </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>536937</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

labeling f-actin barbed ends with rhodamine-actin in permeabilized neuronal growth cones

טיפים ניעתי של אקסונים הגוברת נקראים גביעי צמיחה. קונוסים צמיחה להוביל בניווט אקסונים דרך הרקמות המתפתחות על ידי אינטראקציה עם ביטוי מקומי רמזים הדרכה המולקולרי אשר נקלטות חרוט קולטנים הצמיחה להסדיר את הדינמיקה ארגון של חרוט צמיחה cytoskeleton 3-6. היעד העיקרי של האותות הללו ניווט היא נימה אקטין meshwork הממלא את חרוט צמיחה בפריפריה וכי כוננים חרוט צמיחה תנועתיות באמצעות פילמור אקטין מתמשכת שיפוץ דינמי 7. רמזים הדרכה חיובית או אטרקטיבי לגרום חרוט צמיחה מפנה ידי גירוי אקטין נימה (F-אקטין) פילמור באזור הפריפריה צמיחה חרוט כי הוא קרוב יותר למקור של המקל attractant. זה פילמור אקטין כוננים הצמיחה המקומית חרוט בליטה, הדבקה של השוליים המובילים התארכות axonal כלפי attractant. פילמור אקטין נימה תלוי בזמינות של מונומר אקטין מספיק על גרעינים פילמור או חוט תיל אקטין מסתיים עבור תוספת של מונומר. מונומר אקטין זמין בשפע הגנגליון ברשתית ואת השורש הגבי חומוס (DRG) קונוסים צמיחה. כתוצאה מכך, גדל במהירות כאשר פילמור חינם F-אקטין מסתיים תיל להיות זמינים בנוסף מונומר. זה מתרחש חומוס DRG קונוסים צמיחה הרשתית באמצעות הפעלת המקומית של ה-F-אקטין אקטין ניתוק חלבון depolymerizing גורם (ADF / cofilin) ​​באזור הגידול חרוט קרוב 8-10 attractant. זו פעילות מוגברת ADF / cofilin מנתקת סיבי אקטין ליצור חדש F-אקטין מסתיים תיל פילמור. השיטה הבאה ממחישה את המנגנון הזה. תוכן הכולל של ה-F-אקטין הוא מדמיין על ידי צביעה עם phalloidin ניאון. F-אקטין מסתיים תיל הם דמיינו על ידי שילוב של אקטין rhodamine בתוך קונוסים צמיחה כי הם permeabilized עם ההליך המתואר להלן, אשר מותאם ממחקרים קודמים של תאים אחרים ניעתי 11, 12. כאשר rhodamine-אקטין נוסף בריכוז מעל ריכוז קריטי בנוסף מונומר אקטין מסתיים תיל, rhodamine-אקטין מרכיבה על קצות התיל חינם. אם קיו אטרקטיבית מוצג שיפוע, כגון ששוחרר micropipette ממוקם בצד אחד של חרוט צמיחה, שילוב של rhodamine-אקטין על ה-F-אקטין קצוות התיל יהיה גדול בצד חרוט הצמיחה כלפי micropipette 10 . קונוסים הצמיחה הם מבנים תאים קטנים ועדינים. הנהלים של permeabilization קיבעון rhodamine-אקטין, שילוב ויזואליזציה הקרינה הם עשו בקפידה ניתן לבצע על הבמה של מיקרוסקופ הפוכה. שיטות אלה ניתן ליישם לומד פילמור אקטין המקומית נוירונים נודדים, תאים ורקמות אחרות ראשוני או שורות תאים.

Watch this Scientific Journal Video about Labeling F-actin Barbed Ends with Rhodamine-actin in Permeabilized Neuronal Growth Cones at JoVE.com

Labeling F-actin Barbed Ends with Rhodamine-actin in Permeabilized Neuronal Growth Cones

שיטה לחזות ולכמת F-אקטין מסתיים דוקרני קונוסים הצמיחה העצבית מתוארת. לאחר נוירונים culturing על coverslips זכוכית, תאים permeabilized עם פתרון saponin המכילים. ואז, דגירה קצר עם למאגר saponin המכיל rhodamine-אקטין משלבת אקטין פלואורסצנטי על קצות אקטין חינם תיל.

סימון ה-F-אקטין מסתיים דוקרני עם אקטין Rhodamine ב Permeabilized קונוסים הצמיחה העצבית

The motile tips of growing axons are called growth cones. Growth cones lead navigating axons through developing tissues by interacting with locally ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

תיוג DiOLISTIC של הנוירונים מפני מכרסמים שאינן פרוסות המוח האנושי הפרימאטים

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Automated Sholl Analysis of Digitized Neuronal Morphology at Multiple Scales

ניתוח אוטומטי של מורפולוגיה Sholl העצבית סרוקים בקני מידה מרובים

Neuronal morphology plays a significant role in determining how neurons function and communicate1-3.  Specifically, it affects the ability of neurons to ...

Recording Large-scale Neuronal Ensembles with Silicon Probes in the Anesthetized Rat

הקלטה בקנה מידה גדול הרכבים העצבית עם בדיקות הסיליקון ב עכברוש הרדים

Large scale electrophysiological recordings from neuronal ensembles offer the opportunity to investigate how the brain orchestrates the wide variety of ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

תיוג של פלורסנט מדרדר מאפשר להקלטה ממוקדת חד תאית מיחידת נוירונים שזוהו<em&gt; בvivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

קלטות אלקטרו כפולות של תגובות Astroglial ועצביות עוררו-synaptically בפרוסות ביפוקמפוס חריפות

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

מיקרו-Iontophoresis מהיר של גלוטמט וגאבא: כלי שימושי לחקירת האינטגרציה סינפטית

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells in Adult Zebrafish with Fluorescent Dyes

תיוג מדרדר של תאים ברשתית גנגליון מבוגרים דג הזברה עם צבעי ניאון

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs ...

Preparation of Neuronal Co-cultures with Single Cell Precision

הכנת עצבית שיתוף תרבויות עם Precision תא בודד

Microfluidic embodiments of the Campenot chamber have attracted great interest from the neuroscience community. These interconnected co-culture platforms ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

גרימת פלסטיות של astrocytic רצפטורים על ידי מניפולציה של מחירים ירי עצביים

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons

Quantification of Filamentous Actin F-actin Puncta in Rat Cortical Neurons

כימות פילמנטיות אקטין (F- אקטין) puncta ב עכברוש נוירונים קליפתיים

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich ...