Name: labeling f-actin barbed ends with rhodamine-actin in permeabilized neuronal growth cones
Uploaded: 2011-03-17T11:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Labeling F-actin Barbed Ends with Rhodamine-actin in Permeabilized Neuronal Growth Cones at JoVE.com

Författarna tackar Dr James Bamburg och medlemmar av hans laboratorium för samverkan i dessa studier. Detta arbete har finansierats av NIH bidrag HD19950, EY07133 och med bidrag från Minnesota Medical Foundation.

För Rhodamine-aktin märkning är nervceller odlade på glas täckglas placeras i botten av 35 mm plastskålar, eller på täckglas limmas in i &quot;video&quot; rätter. 1. Beredning av Täckglas eller &quot;Video&quot; rätter <ol><li> Många neuronala typer är dåligt lim in vitro substrat. Glas täckglas, som krävs för detta förfarande, får inte tillräckligt neuron-substrat vidhäftning om de inte är tillräckligt rengjorda och förberedda. Ett detaljerat förfarande f...

<ol>
	<li>Lowery, L. A., Van Vactor, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+trip+of+the+tip:+Understanding+the+growth+cone+machinery.">The trip of the tip: Understanding the growth cone machinery.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 332-343 (2009).</li><li>Letourneau, P., Squire, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+Pathfinding:+Extracellular+Matrix+Role.">Axonal Pathfinding: Extracellular Matrix Role.</a> Encyclopedia of Neuroscience. , 1139-1145 (2008).</li><li>Kalil, K., Dent, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Touch+and+go:+Guidance+cues+signal+to+the+growth+cone+cytoskeleton.">Touch and go: Guidance cues signal to the growth cone cytoskeleton.</a> Curr Opin Neurobio. 15, 521-526 (2005).</li><li>Dent, E. W., Gertler, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeletal+dynamics+and+transport+in+growth+cone+motility+and+axon+guidance.">Cytoskeletal dynamics and transport in growth cone motility and axon guidance.</a> Neuron. 40, 209-227 (2003).</li><li>Pak, C. W., Flynn, K. C., Bamburg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin-binding+proteins+take+the+reins+in+growth+cones.">Actin-binding proteins take the reins in growth cones.</a> Nat Rev Neurosci. 9, 136-147 (2008).</li><li>Guan, K. L., Rao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+mechanisms+mediating+neuronal+responses+to+guidance+cues.">Signaling mechanisms mediating neuronal responses to guidance cues.</a> Nat Rev Neurosci. 4, 941-956 (2003).</li><li>Gallo, G., Letourneau, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+growth+cone+actin+filaments+by+guidance+cues.">Regulation of growth cone actin filaments by guidance cues.</a> J. Neurobiology. 58, 92-102 (2004).</li><li>Fass, J., Gehler, S., Sarmiere, P., Letourneau, P., Bamburg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulating+filopodial+dynamics+through+actin-depolymerizing+factor/cofilin.">Regulating filopodial dynamics through actin-depolymerizing factor/cofilin.</a> Anat Sci Inter. 79, 173-183 (2004).</li><li>Bernstein, B. W., Bamburg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADF/cofilin:+A+functional+node+in+cell+biology.">ADF/cofilin: A functional node in cell biology.</a> Trends Cell Biol. 20, 187-195 (2010).</li><li>Marsick, B. M., Flynn, K. C., Santiago, M., Bamburg, J. R., Letourneau, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+ADF/cofilin+mediates+attractive+growth+cone+turning+toward+nerve+growth+factor+and+netrin-1.">Activation of ADF/cofilin mediates attractive growth cone turning toward nerve growth factor and netrin-1.</a> Dev Neurobiol. 70, 565-588 (2010).</li><li>Symons, M. H., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+actin+polymerization+in+live+and+permeabilized+fibroblasts.">Control of actin polymerization in live and permeabilized fibroblasts.</a> J Cell Biol. 114, 503-513 (1991).</li><li>Chan, A. Y., Raft, S., Bailly, M., Wyckoff, J. B., Segall, J. E., Condeelis, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGF+stimulates+an+increase+in+actin+nucleation+and+filament+number+at+the+leading+edge+of+the+lamellipod+in+mammary+adenocarcinoma+cells.">EGF stimulates an increase in actin nucleation and filament number at the leading edge of the lamellipod in mammary adenocarcinoma cells.</a> J Cell Sci. 111, 199-211 (1998).</li></ol>

De metoder som presenteras här kan tidsmässiga och rumsliga upplösningen i cellulära komponenter som ingår i den dynamiska ombyggnaden av aktin cytoskelettet på ledande marginalen att migrera tillväxt kottar. Den handling av lockbete molekyler, såsom NGF eller netrin, att snabbt stimulera aktin filament polymerisation avslöjas som en lokal ökning av aktin taggtråd slutar, skapad av aktin filament bryta av aktivt ADF / cofilin 10, som visas i figur 1 och 2. Metoden möjliggör lokalisering av andra ...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>18x18 mm coverslip</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gold Seal</td>
<td>3305</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>35mm Petri dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Falcon</td>
<td>351008</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Aquarium cement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>DAP 100% silicone aquarium sealant</td>
<td>Any hardware store</td>
</tr>
<tr>
<td>Poly-D-lysine (mw &gt; 300,000)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P1024</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Natural mouse laminin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>23017-015</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L1 CAM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>R &amp; D systems</td>
<td>777-NC</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Alexa-fluor 350 phalloidin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen (Molecular Probes)</td>
<td>A22281</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rhodamine non-muscle actin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cytoskeleton, Inc.</td>
<td>APHR-A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>F12 Culture medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen (Gibco)</td>
<td>21700-075</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>B27</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen (Gibco)</td>
<td>17504-044</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Slowfade </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>536937</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

labeling f-actin barbed ends with rhodamine-actin in permeabilized neuronal growth cones

Den rörliga tips av växande axoner kallas tillväxt kottar. Tillväxt kottar leda navigera axoner genom att utveckla vävnader genom att interagera med lokalt uttryck molekylära vägledning ledtrådar som binder receptorer tillväxt konen och reglera dynamiken och organisationen av tillväxten konen cytoskelettet 3-6. Det huvudsakliga målet för dessa navigations-signaler är aktin filament meshwork som fyller i periferin tillväxt konen och som driver tillväxten konen motilitet genom ständig aktin polymerisation och dynamiska remodeling 7. Positivt eller attraktiva vägledning cues inducerar tillväxt kotte vrida genom att stimulera aktin filament (F-aktin) polymerisation i regionen av tillväxten konen periferin som är närmast källan till lockbete kö. Detta aktin polymerisation driver lokal tillväxt kotte utstick, vidhäftning av de ledande marginal och axonal töjning mot lockmedel. Aktin filament polymerisation beror på tillgången av tillräckliga aktin monomer och polymerisation atomkärnor eller aktin filament hullingförsedda slutar för tillsättning av monomer. Actin monomer finns i överflöd i chick retinal och dorsala ganglion (DRG) tillväxt kottar. Följaktligen ökar polymerisation snabbt när fri F-aktin taggtråd slutar blir tillgängliga för monomer tillägg. Detta sker i chick DRG och retinal kottar tillväxt via de lokala aktivering av F-aktin bryta proteinet aktin depolymerizing faktor (ADF / cofilin) ​​i tillväxten konen regionen närmare ett lockmedel 8-10. Denna förhöjda ADF / cofilin aktivitet bryter aktin filament för att skapa nya F-aktin taggtråd ändar för polymerisation. Följande metod visar denna mekanism. Totala innehållet av F-aktin är synliga genom färgning med fluorescerande phalloidin. F-aktin taggtråd ändar synliga genom införlivandet av Rhodamine-aktin inom tillväxtområden koner som är permeabilized med det förfarande som beskrivs i följande, som är anpassad från tidigare studier av andra rörliga celler 11, 12. När Rhodamine-aktin läggs vid en koncentration över den kritiska koncentrationen för aktin monomerer Förutom taggtråd ändar, monterar Rhodamine-aktin på fri hullingar slutar. Om attraktiva Cue presenteras i en lutning, som släpps från en mikropipett placerad på ena sidan av en tillväxt kon, kommer införlivandet av Rhodamine-aktin på F-aktin taggtråd slutar vara större i tillväxten konen sidan mot mikropipetten 10 . Tillväxt kottar är små och ömtåliga cellstrukturer. Förfarandena i permeabilization, Rhodamine-aktin bolagsordning, fixering och fluorescens visualisering är alla omsorgsfullt gjort och kan utföras på scenen av ett inverterat mikroskop. Dessa metoder kan tillämpas för att studera lokala aktin polymerisation i migrerar nervceller, andra primära celler vävnad eller cellinjer.

Watch this Scientific Journal Video about Labeling F-actin Barbed Ends with Rhodamine-actin in Permeabilized Neuronal Growth Cones at JoVE.com

Labeling F-actin Barbed Ends with Rhodamine-actin in Permeabilized Neuronal Growth Cones

En metod att visualisera och kvantifiera F-aktin taggtråd slutar i neuronala tillväxt kottar beskrivs. Efter odling nervceller på glas täckglas, celler permeabilized med en saponin-innehållande lösning. Sedan innehåller en kort inkubation med saponin buffert innehållande Rhodamine-aktin fluorescerande aktin på fri aktin hullingar slutar.

Märkning F-aktin Barbed Slutar med Rhodamine-aktin i Permeabilized Neuronal Tillväxt Kottar

The motile tips of growing axons are called growth cones. Growth cones lead navigating axons through developing tissues by interacting with locally ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

DiOLISTIC Märkning av nervceller från gnagare och icke-mänskliga primater Slices Brain

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Automated Sholl Analysis of Digitized Neuronal Morphology at Multiple Scales

Automatiserad Sholl Analys av digitaliserade Neuronal Morfologi på flera skalor

Neuronal morphology plays a significant role in determining how neurons function and communicate1-3.  Specifically, it affects the ability of neurons to ...

Recording Large-scale Neuronal Ensembles with Silicon Probes in the Anesthetized Rat

Inspelning Storskaliga Neuronal Ensembler med Silicon Sonder i sövd Rat

Large scale electrophysiological recordings from neuronal ensembles offer the opportunity to investigate how the brain orchestrates the wide variety of ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Bakåtsträvande Fluorescerande märkning Tillåter Riktade Extracellular Single-enhet Inspelning från identifierade nervceller<em&gt; In vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Dubbla Elektrofysiologiska Inspelningar av synaptiskt-framkallade astrogliala och neuronala svar i akut hippocampus skivor

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Snabb Micro-iontophoresis av glutamat och GABA: Ett användbart verktyg för att undersöka Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells in Adult Zebrafish with Fluorescent Dyes

Retrograd Märkning av retinal ganglion celler i vuxna zebrafisk med fluorescerande färger

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs ...

Preparation of Neuronal Co-cultures with Single Cell Precision

Beredning av Neuronal Co-kulturer med Single Cell Precision

Microfluidic embodiments of the Campenot chamber have attracted great interest from the neuroscience community. These interconnected co-culture platforms ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Induktion Plasticitet hos astrocytiska Receptorer genom manipulering av neuron priser

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons

Quantification of Filamentous Actin F-actin Puncta in Rat Cortical Neurons

Kvantifiering av fintrådiga aktin (F-aktin) puncta i Rat kortikala Neuroner

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich ...