Name: development of a negative selectable marker for entamoeba histolytica
Uploaded: 2010-12-12T17:30:00
Duration: 6 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica at JoVE.com

We willen graag Dr Philippe erbs bedanken voor het verstrekken van ons met de volgorde van FCU1 gen. Dit werk werd ondersteund door NIH subsidie ​​AI 26.649.

1. FCU negatieve selectie System in Entamoeba histolytica <ol><li> De vector controle lijn (HM1 / pKT3M) en de experimentele lijn (HM1/pKT3M-FCU1) werden gegenereerd door de eerder beschreven technieken 1,2. Zaad van de lijnen onder studie van de voorraad buizen in T-25 kolven en te onderhouden selectie door het toevoegen van geschikte antibioticum (12 ug / ml G418) in TYI-S-33 3 medium. De kolven moet 70-80% samenvloeiende na 16-18 uur van de groei op 37 ° C. </li><li> Bereid een verse voorraad 50 mM oplossing van 5-fluorocytosine (5-FC, Sigma) in warm TYI-S-33 medium. Vortex rigoureus een aantal minuten volledig op te lossen 5-FC. Filter-Steriliseer de stock-oplossing door het door een 0,22 urn filter. </li><li> Oogst trofozoïeten door het plaatsen van de kolven op ijs gedurende 3-5 minuten en het verzamelen van de cellen door centrifugeren bij 200xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Resuspendeer de pellet in verse TYI medium en tel de cellen. </li><li> Ontwerp van een typisch experiment maakt gebruik van 0,5 x 10 4 cellen per putje van een 48 wells plaat in een eindvolume van 1 ml, of drie herhalingen voor elke test conditie. Bovendien, om te bevorderen fluorescerende metingen, is een aparte plaat gebruikt voor elke stam per tijdstip. </li><li> Zaad 0,5 x 10 4 cellen per well voor elke test 5-FC concentratie, in drievoud. Handhaaf het antibioticum selectie druk in de TYI medium. Voeg nu de benodigde hoeveelheid van 5-FC stockoplossing aanwezig zijn en trofozoïeten aan elk putje. </li><li> Incubeer de platen in een anaërobe zak bij 37 ° C. </li></ol> 2. Bepaling van de Selectie-efficiëntie <ol><li> Bereid 2 mg / ml stockoplossing van Cell tracker groene CMFDA (Invitrogen) in DMSO. Om de werkende oplossing te verdunnen de voorraad 1000-voudige in serum-vrij TYI medium. </li><li> Volledig verwijderen van het medium uit trophozoite cultuur platen en te vervangen door 150 pi serum-vrij TYI met CMFDA. Ga door incubatie bij 37 ° C gedurende 1 uur. </li><li> Verwijder de kleurstof oplossing uit putten en lees de plaat in de Spectramax M2 microplaat Spectrofluorometer. De excitatie golflengte moet worden vastgesteld op 492 nm en de fluorescentie-emissie te lezen bij 517 nm. </li><li> Vergelijk de fluorescentie waarden voor de controle cellen ten opzichte van de test transfectanten. </li><li> Ga door het lezen van de platen op elk tijdsinterval. Gebruik de juiste positieve (TYI alleen) en negatieve (25 ug / ml hygromycine) controle putten in elk bord. </li></ol> 3. Representatieve resultaten De E. histolytica transfectanten toonde sterke expressie van codon-geoptimaliseerde recombinant FCU1 (figuur 1). Wanneer dit protocol correct wordt nageleefd dit resulteert in selectieve eliminatie van E. histolytica cellen die FCU1 in aanwezigheid van 0,5 mM 5-fluorocytosine. Controle cellen, blijven in tegenstelling tot normaal groeien tot 5 mM concentratie van 5-FC en de samenvloeiing te bereiken tussen 72 en 96 uur (figuur 2-a). De FCU1 die cellen op 48 uur volledig gelyseerd wanneer de behandelde putten worden bekeken onder een microscoop. Deze tonen ook af fluorescentie na kleuring met de vitale kleurstof CMFDA, die wordt gebruikt in kwantitatieve studies waarbij grote aantal monsters (figuur 2-b). Het FCU1/5-FC systeem is een effectieve en krachtige negatieve selectie tool voor E. histolytica trofozoïeten. <img src="/files/ftp_upload/2410/2410fig1.jpg" alt="Figuur 1" /> Figuur 1. Generatie van E. histolytica HM1 transfectanten uiten van negatieve selecteerbare marker (A) FCU1 recombinant eiwit werd ontdekt op een western blot met behulp van anti-c Myc antilichaam (bovenste paneel). Zoals verwacht, zou een 42kDa band worden gedetecteerd (aangegeven door een pijl) in de totale lysaat van de FCU transfectanten, maar niet in de vector alleen controle transfectanten. Het onderste paneel toont dezelfde blot onderzocht met anti actine antilichaam als een laad controle. (B) De resultaten van de kwantitatieve real-time PCR met de expressie van specifieke mRNA FCU1 genormaliseerd tot lgl4 te controleren. <img src="/files/ftp_upload/2410/2410fig2.jpg" alt="Figuur 2" /> Figuur 2. In vitro drug gevoeligheid van E. histolytica transfectanten uiten van negatieve selecteerbare marker Overlevingscurven van (een) controle transfectanten en (b) FCU1 uitdrukken transfectanten gekweekt in 48-well plaat. De cellen werden gekweekt in aanwezigheid van toenemende concentraties van de prodrug-5-fluorocytosine; overleving van de cel werd gekwantificeerd door CMFDA vlekken op elk tijdsinterval zoals aangegeven op de X-as. De Y-as staat voor fluorescentie-eenheden en is een directe weerspiegeling van de overlevende celpopulatie. Houdt u er rekening mee dat de FCU1 uiten transfectanten significant gevoeligheid toonde bij 0,5 mm prodrug concentratie in vergelijking met de controlegroep. Geen cellen werden waargenomen op 120h tijdstip in deze putten als comvergeleken aan de samenvloeiing groei zien in de bijbehorende controle putten onder de microscoop (gegevens niet getoond). Hygro duidt 25μg / ml hygromycine gebruikt als een negatieve controle.

<ol>
	<li>Olvera, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+transfection+of+Entamoeba+histolytica+trophozoites+by+lipofection.">Stable transfection of Entamoeba histolytica trophozoites by lipofection.</a> Arch. Med. Res. , 49-51 (1997).</li><li>Saito-Nakano, Y., Yasuda, T., Nakada-Tsukui, K., Leippe, M., Nozaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab5-associated+vacuoles+play+a+unique+role+in+phagocytosis+of+the+enteric+protozoan+parasite+Entamoeba+histolytica.">Rab5-associated vacuoles play a unique role in phagocytosis of the enteric protozoan parasite Entamoeba histolytica.</a> J. Biol. Chem. 279, 49497-49507 (2004).</li><li>Diamond, L. S., Harlow, D. R., Cunnick, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+medium+for+the+axenic+cultivation+of+Entamoeba+histolytica+and+other+Entamoeba.">A new medium for the axenic cultivation of Entamoeba histolytica and other Entamoeba.</a> Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 72, 431-432 (1978).</li><li>Clark, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Anaerobic parasitic protozoa : genomics and molecular biology. , (2010).</li><li>Linford, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+hairpin+RNA-mediated+knockdown+of+protein+expression+in+Entamoeba+histolytica.">Short hairpin RNA-mediated knockdown of protein expression in Entamoeba histolytica.</a> BMC Microbiol. 9, 38-38 (2009).</li><li>Solis, C. F., Guill&#233;n, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+genes+by+RNA+interference+in+the+protozoan+parasite+Entamoeba+histolytica.">Silencing genes by RNA interference in the protozoan parasite Entamoeba histolytica.</a> Methods Mol. Biol. 442, 113-128 (2008).</li><li>Solis, C. F., Santi-Rocca, J., Perdomo, D., Weber, C., Guill&#233;n, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+bacterially+expressed+dsRNA+to+downregulate+Entamoeba+histolytica+gene+expression.">Use of bacterially expressed dsRNA to downregulate Entamoeba histolytica gene expression.</a> PLoS ONE. 4, e8424-e8424 (2009).</li><li>MacFarlane, R. C., Singh, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+dsRNA-based+gene+silencing+in+Entamoeba+histolytica:+implications+for+approaches+to+genetic+analysis.">Loss of dsRNA-based gene silencing in Entamoeba histolytica: implications for approaches to genetic analysis.</a> Exp. Parasitol. 119, 296-300 (2008).</li><li>Dhar, S. K., Vines, R. R., Bhattacharya, S., Petri, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosomal+DNA+fragments+enhance+the+stability+of+transfected+DNA+in+Entamoeba+histolytica.">Ribosomal DNA fragments enhance the stability of transfected DNA in Entamoeba histolytica.</a> J. Eukaryot. Microbiol. 45, 656-660 (1998).</li><li>Erbs, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+cancer+gene+therapy+by+adenovirus-mediated+transfer+of+a+bifunctional+yeast+cytosine+deaminase/uracil+phosphoribosyltransferase+fusion+gene.">In vivo cancer gene therapy by adenovirus-mediated transfer of a bifunctional yeast cytosine deaminase/uracil phosphoribosyltransferase fusion gene.</a> Cancer Res. 60, 3813-3822 (2000).</li><li>Braks, J. A. M., Franke-Fayard, B., Kroeze, H., Janse, C. J., Waters, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+application+of+a+positive-negative+selectable+marker+system+for+use+in+reverse+genetics+in+Plasmodium.">Development and application of a positive-negative selectable marker system for use in reverse genetics in Plasmodium.</a> Nucleic Acids Res. 34, e39-e39 (2006).</li><li>Maier, A. G., Braks, J. A. M., Waters, A. P., Cowman, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+selection+using+yeast+cytosine+deaminase/uracil+phosphoribosyl+transferase+in+Plasmodium+falciparum+for+targeted+gene+deletion+by+double+crossover+recombination.">Negative selection using yeast cytosine deaminase/uracil phosphoribosyl transferase in Plasmodium falciparum for targeted gene deletion by double crossover recombination.</a> Mol. Biochem. Parasitol. 150, 118-121 (2006).</li></ol>

De productie van deze video werd gesponsord door Sigma Aldrich, Inc, die een aantal van de gebruikte reagentia in dit artikel oplevert.

Hoewel er aanzienlijke vooruitgang in de Entamoeba moleculaire biologische tools zijn er geen actuele methoden beschikbaar om te verwijderen of verstoren genen 4. Knockdown van gen-specifieke expressie is bereikt door het gebruik van de hairpin RNA&#39;s 5, kleine interfererende RNA 6 en bacterieel uitgedrukt dsRNA 7. Maar deze methoden, terwijl effectief voor de respectieve streefwaarden genen, hebben een aantal beperkingen zoals het gebruik van dure chemicaliën, continue selectie tegen antibiotica en de noodzaak voor constante validatie door de hoge incidentie van terugval die zich in de tijd (Alicia Linford, persoonlijke communicatie) 8. Elke plasmide kan repliceren in Entamoeba want er is blijkbaar niet een strikte volgorde vereiste voor oorsprong van de DNA-replicatie 9, en dus als getransfecteerd, is het meestal moeilijk om een plasmide te genezen. Dit beperkt het mogelijke gebruik van intacte plasmiden in recombinatie en knockout experimenten. Negatieve selectie markers zijn belangrijke componenten van gen-targeting methodes als ze kunnen worden gebruikt om recombinant subpopulaties te elimineren. We hebben met succes een uitgesproken codon geoptimaliseerd FCU1 gen in Entamoeba histolytica en getest zijn potentieel als een negatief selecteerbare marker. Dit gen fusie werd gebruikt voor zelfmoord gentherapie van menselijke tumorcellen en metaboliseert de prodrug 5-FC in giftige downstream producten, resulterend in remming van RNA en DNA-synthese 10. FCU1 is onlangs gebruikt als een negatief selecteerbare marker in Plasmodium, een ander protozoaire parasiet. Plasmodium berghei cellen die FCU1 bleken bijna 1000 keer meer gevoelig voor de prodrug in vitro en in vivo behandeling met 5-FC doodde meer dan 99,9% van de infecteren recombinant parasieten in de erytrocytaire fase muismodel van malaria 11. E. histolytica cellen die FCU1 toonde slechts een 30-voudige verhoogde gevoeligheid voor de prodrug 5-FC in tegenstelling tot de gevoeligheid waargenomen in P. berghei. Mogelijke redenen hiervoor kan grote pool van nucleotiden in het groeimedium concurreren met de giftige metabolieten worden. In beide P. berghei en P. falciparum de FCU1 marker is gebruikt in gerichte gendisruptie. studies 11,12. Wij streven ernaar om de Entamoeba genoom met behulp van homologe recombinatie te manipuleren. De validatie van de FCU1/5-FC negatieve selectie systeem is een belangrijke stap in de richting van dit doel.

<table border="1">
<tr>
<td>Material Name</td>
<td>Type</td>
<td>Company</td>
<td>Catalogue Number</td>
<td>Comments</td>
</tr>
<tr>
<td>TYI-S-33 medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ATCC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Reference included in the text</td>
</tr>
<tr>
<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=F7129|SIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO|BRAND_KEY&F=SPEC">5-Fluorocytosine</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>F7129</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cell tracker green CMFDA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>C2925</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Spectra Max M2 plate-reader</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		
</table>

development of a negative selectable marker for entamoeba histolytica

Entamoeba histolytica is de veroorzaker van amebiasis en infecteert tot 10% van de wereldbevolking. De moleculaire technieken die in staat hebben gesteld de up-en down-regulatie van genexpressie vertrouwen op de transfectie van stabiel blijft plasmiden. Hoewel deze hebben onze kennis van Entamoeba virulentiefactoren, de capaciteit om exogeen DNA te integreren in het genoom, die het mogelijk maken reverse genetics experimenten, zou een belangrijk voordeel zijn in de studie van deze parasiet. De uitdagingen van dit organisme zijn onvermogen om te kiezen voor homologe recombinatie gebeurtenissen en problemen bij het episomale plasmide DNA genezen van getransfecteerde trofozoïeten. De latere resulteert in een hoge achtergrond van exogeen DNA, een groot probleem bij de identificatie van trofozoïeten waarin een bonafide genomische integratie gebeurtenis heeft plaatsgevonden. Wij rapporteren de ontwikkeling van een negatieve selectie systeem dat gebaseerd is op transgene expressie van een gist cytosine en uracil deaminase fosforibosyltransferase Chimera (FCU1) en de selectie met prodrug 5-fluorocytosine (5-FC). De FCU1 enzym zet niet-toxische 5-FC in giftige 5-fluorouracil en 5-fluoro-5&#39;-monofosfaat. E. histolytica lijnen uitdrukken FCU1 bleken 30 keer gevoeliger voor de prodrug vergelijking met de controlegroep stam te zijn.

Watch this Scientific Journal Video about Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica at JoVE.com

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

Wij rapporteren de ontwikkeling van een negatieve selectie systeem in<em&gt; E. histolytica</em&gt; Op basis van transgene expressie van een chimeer eiwit (FCU1) en selectie met de prodrug 5-fluorocytosine. De FCU1 eiwit is een fusie van gist cytosine en uracil deaminase fosforibosyl. Expressie van FCU1 resulteerde in een verhoogde<em&gt; E. histolytica</em&gt; Gevoeligheid voor 5-fluorocytosine.

Ontwikkeling van een negatieve selecteerbare marker voor Entamoeba histolytica</em

Entamoeba histolytica is the causative agent of amebiasis and infects up to 10% of the world's population. The molecular techniques that have enabled the ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

In vitro tRNA Methylation Assay with the Entamoeba histolytica DNA and tRNA Methyltransferase Dnmt2 (Ehmeth) Enzyme

In vitro tRNA Methylation Assay with the Entamoeba histolytica DNA and tRNA Methyltransferase Dnmt2 Ehmeth Enzyme

In vitro tRNA methylatie test met de Entamoeba histolytica DNA en tRNA methyltransferase Dnmt2 (Ehmeth) Enzym

Protozoan parasites are among the most devastating infectious agents of humans responsible for a variety of diseases including amebiasis, which is one of ...

Examination of Thymic Positive and Negative Selection by Flow Cytometry

Onderzoek van thymus positieve en negatieve selectie via flowcytometrie

A healthy immune system requires that T cells respond to foreign  antigens while remaining tolerant to self-antigens. Random rearrangement of the  T cell ...

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

Met Click Chemie aan het effect van de virale infectie Meet op Host-cel RNA Synthese

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

Snelle identificatie van Gram-negatieve bacteriën van Blood Culture Bouillon Met behulp van MALDI-TOF massaspectrometrie

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Analyse van de epitheelbeschadiging Geproduceerd door<em&gt; Entamoeba histolytica</em&gt; Infectie

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is ...

Detection of Human Leukocyte Antigen Biomarkers in Breast Cancer Utilizing Label-free Biosensor Technology

Detectie van Humaan leukocytenantigeen Biomarkers bij Borstkanker Gebruikmakend-Label gratis biosensortechnologie

According to the American Cancer Society, more than 200,000 women will be diagnosed with invasive breast cancer each year and approximately 40,000 will ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Het visualiseren van de effecten van het sputum op biofilm ontwikkeling met behulp van een chambered dekglaasje Model

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle

Ontwikkeling van een Hepatitis B Virus reportersysteem de vroege stadia van de replicatiecyclus Monitor

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), ...

Utilization of Capsules for Negative Staining of Viral Samples within Biocontainment

Gebruik van capsules voor negatief vlekken van virale monsters in biocontainment

Transmission electron microscopy (TEM) is used to observe the ultrastructure of viruses and other microbial pathogens with nanometer resolution. Most ...

Simultaneous Distinction of Monospecific and Mixed DFS70 Patterns During ANA Screening with a Novel HEp-2 ELITE/DFS70 Knockout Substrate

Gelijktijdige onderscheid van monospecifieke en gemengde DFS70 patronen tijdens ANA Screening met een roman HEp-2 ELITE/DFS70 Knockout substraat

Systemic autoimmune connective tissue disorders are characterized by circulating antinuclear antibodies (ANA). Although there are several technologies ...