Name: development of a negative selectable marker for entamoeba histolytica
Uploaded: 2010-12-12T17:30:00
Duration: 6 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica at JoVE.com

ברצוננו להודות לד&quot;ר Erbs פיליפ לספק לנו את הרצף של הגן FCU1. עבודה זו נתמכה על ידי NIH מענק AI 26649.

1. FCU מערכת סלקציה שלילית ב Entamoeba histolytica <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקרת וקטור קו (HM1 / pKT3M) ואת קו ניסיוני (HM1/pKT3M-FCU1) נוצרו על ידי 1,2 הטכניקות המתוארות קודם לכן. זרעים הקווים תחת מחקר מן המניות לתוך צינורות T-25 צלוחיות ולשמור הבחירה על ידי הוספת אנטיביוטיקה המתאימה (12 מיקרוגרם / מ&quot;ל G418) בינוני 3 TYI-S-33. צלוחיות צריך להיות 70-80% ומחוברות לאחר 16-18 שעות של צמיחה ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון טרי המניות של 5-50mm Fluorocytosine (5-FC, Sigma) במדיום TYI-S-33 חם. וורטקס בקפדנות במשך מספר דקות לפרק 5-FC לחלוטין. מסנן לעקר את הפתרון המניות על ידי העברתו דרך מסנן 0.22 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר trophozoites ידי הצבת צלוחיות על קרח למשך 3-5 דקות לאסוף את התאים על ידי centrifuging ב 200xg במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. Resuspend גלולה במדיום TYI טריים לספור את התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיצוב של ניסוי טיפוסי משתמשת 0.5 x 10 4 תאים לכל גם צלחת 48 באר נפח סופי של 1 מ&quot;ל, וחוזר בשלושה עותקים עבור כל תנאי הבדיקה. בנוסף, כדי להקל על המדידות ניאון, צלחת נפרדת משמש עבור כל זן לכל נקודת זמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.5 Seed x 10 4 תאים לכל טוב עבור כל בדיקה 5-FC ריכוז, בשלושה עותקים. שמירה על לחץ ברירה אנטיביוטי במדיום TYI. עכשיו להוסיף את הכמות הנדרשת של פתרון FC-5 המניות trophozoites היטב כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צלחות בתיק אנאירובי על 37 ° C. </li></ol> 2. קביעת יעילות לבחירה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 2 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​פתרון המניות של תא גשש ירוק CMFDA (Invitrogen) ב DMSO. כדי להפוך את הפתרון עובד לדלל את המניות של פי 1000 בינוני TYI בסרום חינם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את בינוני לחלוטין צלחות תרבות trophozoite ולהחליף 150 CMFDA μL TYI סרום ללא המכיל. המשך דגירה על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הפתרון לצבוע מבארות ולקרוא את הצלחת spectrofluorometer M2 microplate Spectramax. גל עירור צריך להיות מוגדר ב 492 ננומטר ואת פליטת הקרינה לקרוא 517 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השווה את ערכי הקרינה עבור התאים מלאה מול transfectants הבדיקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך לקרוא את הלוחות במרווח בכל פעם. שימוש חיובי המתאים (TYI בלבד) והשלילי (25 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​hygromycin) בארות שליטה כל צלחת. </li></ol> 3. נציג תוצאות E. transfectants histolytica הראו ביטוי חזק של FCU1 קודון רקומביננטי אופטימיזציה (איור 1). כאשר פרוטוקול זה הוא לאחר נכונה התוצאה היא חיסול סלקטיבי של E. histolytica תאים להביע FCU1 בנוכחות מ&quot;מ 0.5 5 fluorocytosine. תאים הבקרה, בניגוד להמשיך לצמוח בדרך כלל במהירות של עד 5 מ&quot;מ בריכוז של 5-FC ולהגיע מפגש בין 72 לבין 96 שעות (איור 2). FCU1 התאים נושאת ב 48 שעות הם lysed לחלוטין כאשר בארות מטופלים הם מתחת למיקרוסקופ. אלה גם להראות ירידה הקרינה כאשר מוכתמות חיוני לצבוע CMFDA, המשמש במחקרים כמותיים מעורבים מספר גדול של דגימות (תמונה 2 ב). מערכת FCU1/5-FC היא כלי אפקטיבי ורב עוצמה סלקציה שלילית עבור E. histolytica trophozoites. <img src="/files/ftp_upload/2410/2410fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. הדור של E. histolytica HM1 transfectants להביע סמן לבחירה שלילית (א) חלבון רקומביננטי FCU1 זוהה על כתם המערבי באמצעות נוגדן אנטי-c myc (הפאנל העליון). כצפוי, הלהקה 42kDa ניתן היה לזהות (המוצג על ידי החץ) ב lysate הכולל מן transfectants FCU אך לא וקטור לבד transfectants שליטה. הפאנל התחתון מראה את אותו כתם נחקר עם נוגדן אנטי אקטין כביקורת הטעינה. (ב) תוצאות של זמן אמת כמותי PCR מראה ביטוי של mRNA FCU1 ספציפי מנורמל לשלוט lgl4. <img src="/files/ftp_upload/2410/2410fig2.jpg" alt="איור 2" /> 2. איור במבחנה התרופה הרגישות של E. histolytica transfectants להביע סמן לבחירה שלילית הישרדות של עקומות (א) transfectants מלאה (ב) transfectants FCU1 להביע בתרבית בצלחת 48-היטב. התאים גדלו בנוכחות ריכוזים הגוברת של prodrug-5-fluorocytosine; הישרדות התא היה לכמת ידי מכתים CMFDA במרווח כל הזמן מסומן על ציר ה-X. ציר Y מייצג יחידות פלואורסצנטי הוא השתקפות ישירה של האוכלוסייה התא לשרוד. שים לב FCU1 transfectants להביע הראו רגישות משמעותית בריכוז prodrug 0.5mm לעומת שליטה. תאים לא נצפו בנקודת זמן 120h אלה בארות כמו compared לצמיחה ומחוברות לראות את הבארות בקרה המתאימים תחת מיקרוסקופ (מידע לא מוצג). Hygro מציין 25μg / mL hygromycin לשמש מלאה שלילי.

<ol>
	<li>Olvera, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+transfection+of+Entamoeba+histolytica+trophozoites+by+lipofection.">Stable transfection of Entamoeba histolytica trophozoites by lipofection.</a> Arch. Med. Res. , 49-51 (1997).</li><li>Saito-Nakano, Y., Yasuda, T., Nakada-Tsukui, K., Leippe, M., Nozaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab5-associated+vacuoles+play+a+unique+role+in+phagocytosis+of+the+enteric+protozoan+parasite+Entamoeba+histolytica.">Rab5-associated vacuoles play a unique role in phagocytosis of the enteric protozoan parasite Entamoeba histolytica.</a> J. Biol. Chem. 279, 49497-49507 (2004).</li><li>Diamond, L. S., Harlow, D. R., Cunnick, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+medium+for+the+axenic+cultivation+of+Entamoeba+histolytica+and+other+Entamoeba.">A new medium for the axenic cultivation of Entamoeba histolytica and other Entamoeba.</a> Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 72, 431-432 (1978).</li><li>Clark, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Anaerobic parasitic protozoa : genomics and molecular biology. , (2010).</li><li>Linford, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+hairpin+RNA-mediated+knockdown+of+protein+expression+in+Entamoeba+histolytica.">Short hairpin RNA-mediated knockdown of protein expression in Entamoeba histolytica.</a> BMC Microbiol. 9, 38-38 (2009).</li><li>Solis, C. F., Guill&#233;n, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+genes+by+RNA+interference+in+the+protozoan+parasite+Entamoeba+histolytica.">Silencing genes by RNA interference in the protozoan parasite Entamoeba histolytica.</a> Methods Mol. Biol. 442, 113-128 (2008).</li><li>Solis, C. F., Santi-Rocca, J., Perdomo, D., Weber, C., Guill&#233;n, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+bacterially+expressed+dsRNA+to+downregulate+Entamoeba+histolytica+gene+expression.">Use of bacterially expressed dsRNA to downregulate Entamoeba histolytica gene expression.</a> PLoS ONE. 4, e8424-e8424 (2009).</li><li>MacFarlane, R. C., Singh, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+dsRNA-based+gene+silencing+in+Entamoeba+histolytica:+implications+for+approaches+to+genetic+analysis.">Loss of dsRNA-based gene silencing in Entamoeba histolytica: implications for approaches to genetic analysis.</a> Exp. Parasitol. 119, 296-300 (2008).</li><li>Dhar, S. K., Vines, R. R., Bhattacharya, S., Petri, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosomal+DNA+fragments+enhance+the+stability+of+transfected+DNA+in+Entamoeba+histolytica.">Ribosomal DNA fragments enhance the stability of transfected DNA in Entamoeba histolytica.</a> J. Eukaryot. Microbiol. 45, 656-660 (1998).</li><li>Erbs, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+cancer+gene+therapy+by+adenovirus-mediated+transfer+of+a+bifunctional+yeast+cytosine+deaminase/uracil+phosphoribosyltransferase+fusion+gene.">In vivo cancer gene therapy by adenovirus-mediated transfer of a bifunctional yeast cytosine deaminase/uracil phosphoribosyltransferase fusion gene.</a> Cancer Res. 60, 3813-3822 (2000).</li><li>Braks, J. A. M., Franke-Fayard, B., Kroeze, H., Janse, C. J., Waters, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+application+of+a+positive-negative+selectable+marker+system+for+use+in+reverse+genetics+in+Plasmodium.">Development and application of a positive-negative selectable marker system for use in reverse genetics in Plasmodium.</a> Nucleic Acids Res. 34, e39-e39 (2006).</li><li>Maier, A. G., Braks, J. A. M., Waters, A. P., Cowman, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+selection+using+yeast+cytosine+deaminase/uracil+phosphoribosyl+transferase+in+Plasmodium+falciparum+for+targeted+gene+deletion+by+double+crossover+recombination.">Negative selection using yeast cytosine deaminase/uracil phosphoribosyl transferase in Plasmodium falciparum for targeted gene deletion by double crossover recombination.</a> Mol. Biochem. Parasitol. 150, 118-121 (2006).</li></ol>

ההפקה של הוידאו הזה מומן על ידי חברת סיגמא אלדריץ&#39;, Inc, אשר מייצרת כמה חומרים כימיים המשמשים במאמר זה.

אמנם יש כבר התקדמות ניכרת כלים Entamoeba ביולוגי מולקולרי אין השיטות הקיימות זמין למחוק או לשבש גנים 4. מציאה של ביטוי גנים ספציפיים הושג על ידי שימוש RNAs מכבנה 5, קטן מפריע RNA 6 והביע bacterially dsRNA 7. אולם שיטות אלו תוך יעיל עבור גני מטרה בהתאמה, יש מספר מגבלות, כולל שימוש בכימיקלים יקרים, מבחר מתמשך נגד אנטיביוטיקה את הצורך באימות מתמדת עקב שכיחות גבוהה של חזרה המתרחשים לאורך זמן (אלישיה Linford, תקשורת אישית) 8. הפלסמיד כל יכול לשכפל Entamoeba כפי שיש כנראה לא דרישה רצף קפדנית על מקורותיה של שכפול הדנ&quot;א 9, transfected כך פעם, זה בדרך כלל קשה לרפא פלסמיד. זה מגביל את השימוש האפשרי של פלסמידים שלמים בניסויים רקומבינציה ואת הגן בנוקאאוט. סמני סלקציה שלילית הם רכיבי מפתח של גן מיקוד שיטות כפי שהם יכולים לשמש כדי לחסל subpopulations רקומביננטי. אנחנו הבענו בהצלחה קודון אופטימיזציה FCU1 גנים Entamoeba histolytica נבדק הפוטנציאל שלה כסמן לבחירה שלילית. היתוך גן זה שימש לטיפול גן התאבדות של תאים סרטניים אנושיים חילוף החומרים prodrug 5-FC למוצרים במורד רעילים וכתוצאה מכך עיכוב סינתזה של RNA-DNA 10. FCU1 שימש לאחרונה כסמן לבחירה שלילית Plasmodium, עוד טפיל protozoan. Plasmodium תאים berghei להביע FCU1 נמצאו 1000 כמעט פי רגישים יותר prodrug במבחנה טיפול vivo עם 5-FC נהרגו מעל 99.9% של הדבקה של טפילים רקומביננטי במודל האריתרוציטים בשלב העכבר של מלריה 11. E. תאים histolytica להביע FCU1 הראו רק רגישות פי 30 עלה ל prodrug 5-FC בניגוד רגישות שנצפתה פ berghei. הסיבות האפשריות לכך יכולה להיות מאגר גדול של נוקלאוטידים הזמינים בינוני הצמיחה מתחרים עם מטבוליטים רעילים. בשני פ berghei ו פ falciparum סמן FCU1 נעשה שימוש שיבוש גנטי ממוקד. מחקרים 11,12. אנו שואפים לשנות את הגנום Entamoeba באמצעות הומולוגיים רקומבינציה. אימות של מערכת מבחר FCU1/5-FC השלילי הוא צעד משמעותי לקראת המטרה הזאת.

<table border="1">
<tr>
<td>Material Name</td>
<td>Type</td>
<td>Company</td>
<td>Catalogue Number</td>
<td>Comments</td>
</tr>
<tr>
<td>TYI-S-33 medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ATCC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Reference included in the text</td>
</tr>
<tr>
<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=F7129|SIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO|BRAND_KEY&F=SPEC">5-Fluorocytosine</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>F7129</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cell tracker green CMFDA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>C2925</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Spectra Max M2 plate-reader</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		
</table>

development of a negative selectable marker for entamoeba histolytica

Entamoeba histolytica הוא סוכן סיבתי של amebiasis ומדביק עד 10% מאוכלוסיית העולם. בטכניקות מולקולריות אפשרו למעלה ולמטה ויסות של ביטוי גנים להסתמך על transfection של פלסמידים נשמר ביציבות. בעוד אלה הגדילו את ההבנה שלנו של גורמים Entamoeba ארסיות, היכולת לשלב את ה-DNA אקסוגני לתוך הגנום, אשר תאפשר להפוך ניסויים גנטיקה, יהיה יתרון משמעותי במחקר של טפיל זה. האתגרים שהוצגו על ידי אורגניזם זה כוללים חוסר יכולת לבחור עבור הומולוגיים אירועי רקומבינציה וקושי לרפא DNA פלסמיד episomal מ trophozoites transfected. התוצאות מאוחר יותר ברקע גבוהה של DNA אקסוגני, בעיה מרכזית בזיהוי של trophozoites שבו אירוע בתום לב אינטגרציה הגנומי התרחשה. אנו מדווחים על פיתוח של מערכת המבוססת על סלקציה שלילית ביטוי מהונדס של דאמינז שמרים ציטוזין אורציל transferase phosphoribosyl הכימרה (FCU1) ובחירת עם prodrug 5-fluorocytosine (5-FC). האנזים ממיר FCU1 רעיל 5-FC לתוך fluorouracil-5 רעילים 5-fluorouridine-5&#39;-monophosphate. E. קווי histolytica להביע FCU1 נמצאו 30 לקפל רגישים יותר prodrug לעומת זן הביקורת.

Watch this Scientific Journal Video about Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica at JoVE.com

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

אנו מדווחים על פיתוח של מערכת בחירה שלילית<em&gt; א histolytica</em&gt; מבוסס על ביטוי של חלבון מהונדס chimeric (FCU1) ובחירת עם prodrug 5-fluorocytosine. החלבון FCU1 הוא שילוב של דאמינז שמרים ציטוזין אורציל phosphoribosyltransferase. הביטוי של FCU1 הביא מוגבר<em&gt; א histolytica</em&gt; רגישות כלפי 5-fluorocytosine.

פיתוח מרקר לבחירה שלילי Entamoeba histolytica</em

Entamoeba histolytica is the causative agent of amebiasis and infects up to 10% of the world's population. The molecular techniques that have enabled the ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

In vitro tRNA Methylation Assay with the Entamoeba histolytica DNA and tRNA Methyltransferase Dnmt2 (Ehmeth) Enzyme

In vitro tRNA Methylation Assay with the Entamoeba histolytica DNA and tRNA Methyltransferase Dnmt2 Ehmeth Enzyme

ב Assay tRNA מתילציה במבחנה עם histolytica Entamoeba דנ&quot;א Dnmt2 tRNA methyltransferase (Ehmeth) אנזימים

Protozoan parasites are among the most devastating infectious agents of humans responsible for a variety of diseases including amebiasis, which is one of ...

Examination of Thymic Positive and Negative Selection by Flow Cytometry

בחינה של בחירה חיובית ושלילית הרתי ידי זרימת cytometry

A healthy immune system requires that T cells respond to foreign  antigens while remaining tolerant to self-antigens. Random rearrangement of the  T cell ...

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

שימוש בכימיה לחץ כדי למדוד את ההשפעה של זיהום ויראלי בסינתזת RNA Host-Cell

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

זיהוי מהיר של חיידקים גראם שליליים מהדם תרבות מרק שימוש MALDI-TOF המוני ספקטרומטריית

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

ניתוח של נזק אפיתל הופק על ידי<em&gt; Histolytica Entamoeba</em&gt; זיהום

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is ...

Detection of Human Leukocyte Antigen Biomarkers in Breast Cancer Utilizing Label-free Biosensor Technology

איתור של יקוציט האדם Antigen Biomarkers בסרטן שד ניצול הטכנולוגיה biosensor ללא תווית

According to the American Cancer Society, more than 200,000 women will be diagnosed with invasive breast cancer each year and approximately 40,000 will ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

לדמיין את ההשפעות של כיח על פיתוח biofilm באמצעות מודל תאיים coverglass

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle

פיתוח של מערכת Reporter וירוס הפטיטיס B לפקח בשלבים המוקדמים של מחזור שכפול

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), ...

Utilization of Capsules for Negative Staining of Viral Samples within Biocontainment

ניצול של קפסולות עבור מכתים שלילי של דגימות ויראלי בתוך Biocontainment

Transmission electron microscopy (TEM) is used to observe the ultrastructure of viruses and other microbial pathogens with nanometer resolution. Most ...

Simultaneous Distinction of Monospecific and Mixed DFS70 Patterns During ANA Screening with a Novel HEp-2 ELITE/DFS70 Knockout Substrate

ההבחנה סימולטני של Monospecific ודפוסי DFS70 מעורב במהלך ההקרנה אנה עם מצע נוקאאוט הרומן של עלית/DFS70 דלקת-2

Systemic autoimmune connective tissue disorders are characterized by circulating antinuclear antibodies (ANA). Although there are several technologies ...