Name: development of a negative selectable marker for entamoeba histolytica
Uploaded: 2010-12-12T17:30:00
Duration: 6 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica at JoVE.com

Мы хотели бы поблагодарить д-ра Филиппа Эрбс за предоставление нам последовательность FCU1 гена. Эта работа была поддержана NIH грант А. И. 26649.

1. FCU Отрицательные Выбор системы в Entamoeba histolytica <ol><li> Линии векторного управления (HM1 / pKT3M) и экспериментальной линии (HM1/pKT3M-FCU1) были сгенерированы ранее описанных 1,2 техник. Семенной линий при исследовании со склада трубы в Т-25 колб и поддерживать выбор, добавив соответствующий антибиотик (12 мкг / мл G418) в Tyi-S-33, 3 средних. Колбы должна быть 70-80% сливной после 16-18 часов роста при 37 ° C. </li><li> Подготовка свежей 50 мМ маточного раствора из 5-Fluorocytosine (5-FC, Sigma) в теплой Tyi-S-33 среды. Vortex строго в течение нескольких минут, чтобы растворить 5-ФК полностью. Фильтр-стерилизовать маточного раствора, пропуская ее через фильтр 0,22 мкм. </li><li> Урожай трофозоиты путем размещения колбы на льду в течение 3-5 минут и сбора клетки центрифугированием при 200xg в течение 5 минут при комнатной температуре. Ресуспендируют пеллет в свежую среду Tyi и считать клетки. </li><li> Дизайн типичном эксперименте используется 0,5 х 10 4 клеток на лунку 48-луночного планшета в конечном объеме 1 мл, и трижды повторяется для каждого теста состоянии. Кроме того, для облегчения флуоресцентных измерений, отдельная пластина используется для каждого штамма на момент времени. </li><li> Семенной 0,5 х 10 4 клеток на лунку для каждого теста 5-ФК концентрации, в трех экземплярах. Поддержание давления отбора антибиотика в среде Tyi. Теперь добавьте необходимое количество 5-ФК маточного раствора и трофозоиты в каждую лунку. </li><li> Инкубируйте пластин в анаэробных мешок при температуре 37 ° C. </li></ol> 2. Определение эффективности выбора <ol><li> Подготовка 2 мг / мл исходного раствора сотовый трекера зеленые CMFDA (Invitrogen) в ДМСО. Чтобы сделать рабочий раствор разбавить акции в 1000 раз в бессывороточной среде Tyi. </li><li> Удалить среду полностью из трофозоит пластин культуры и заменить 150 мкл бессывороточной Tyi содержащие CMFDA. Продолжить инкубации при температуре 37 ° С в течение 1 часа. </li><li> Удалить раствор красителя из колодцев и читать пластины в spectrofluorometer Spectramax М2 планшет. Длины волны возбуждения должна быть установлена ​​на 492 нм и флуоресценции выбросов читать на 517 нм. </li><li> Сравните флуоресценции значения для контрольных клеток по сравнению с тест трансфектантов. </li><li> Продолжить чтение пластин на каждом временном интервале. Используйте соответствующие положительные (Tyi только) и отрицательные (25 мкг / мл гигромицину) контроль скважин в каждую тарелку. </li></ol> 3. Представитель Результаты E. histolytica трансфектантов показал надежную выражение кодон оптимизированы рекомбинантный FCU1 (рис. 1). При этом протоколе следует правильно это приводит к селективной ликвидации Е. histolytica клеток, экспрессирующих FCU1 в присутствии 0,5 мМ 5-fluorocytosine. Управление клетки, в отличие продолжают нормально расти со скоростью до 5 мМ концентрация 5-ФК и достичь слияния между 72 и 96 часов (рис. 2-а). FCU1 проведения клеток на 48 часов полностью лизируются при обработанных скважин рассматриваются под микроскопом. Они также показывают, снизилась флуоресценции при окраске жизненно красителя CMFDA, который используется в количественных исследований с участием большого количества образцов (рис. 2-б). FCU1/5-FC система эффективный и мощный отрицательный выбор инструмента для E. histolytica трофозоиты. <img src="/files/ftp_upload/2410/2410fig1.jpg" alt="Рисунок 1" /> Рисунок 1. Генерация Е. histolytica HM1 трансфектантов выражения отрицательных селективного маркера () FCU1 рекомбинантный белок был обнаружен на западном пятно с использованием анти-Myc с антителом (верхняя часть). Как и ожидалось, 42kDa группа могла быть обнаружена (показан стрелкой) в общем лизат из трансфектантов FCU, но не в один вектор управления трансфектантов. Нижняя панель показывает то же самое пятно исследовали с антителами анти актина в качестве управления загрузкой. (Б) Результаты количественной ПЦР в реальном времени показывает выражение FCU1 конкретные мРНК нормированная на lgl4 контроля. <img src="/files/ftp_upload/2410/2410fig2.jpg" alt="Рисунок 2" /> Рисунок 2. Экстракорпоральное лекарственной чувствительности Е. histolytica трансфектантов выражения отрицательных селективного маркера Кривые выживаемости (а) контроль трансфектантов и (б) FCU1 выражения трансфектантов культивировали в 48-луночного планшета. Клетки, выращенные в присутствии увеличивающихся концентраций пролекарство-5-fluorocytosine; выживаемость клеток была количественно окрашиванием CMFDA на каждом временном интервале, как обозначается на оси абсцисс. Y-ось представляет флуоресценции единиц и является прямым отражением выживания клеточной популяции. Обратите внимание, что FCU1 выражения трансфектантов показали значительное чувствительности при концентрации 0,5 пролекарство по сравнению с контролем. Нет клетки были обнаружены в момент времени 120 часов в этих скважинах по сравпо сравнению с сплошной рост видели в соответствующие лунки контроль под микроскопом (данные не приведены). Гигро обозначает 25μg / мл гигромицину использовать в качестве отрицательного контроля.

<ol>
	<li>Olvera, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+transfection+of+Entamoeba+histolytica+trophozoites+by+lipofection.">Stable transfection of Entamoeba histolytica trophozoites by lipofection.</a> Arch. Med. Res. , 49-51 (1997).</li><li>Saito-Nakano, Y., Yasuda, T., Nakada-Tsukui, K., Leippe, M., Nozaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab5-associated+vacuoles+play+a+unique+role+in+phagocytosis+of+the+enteric+protozoan+parasite+Entamoeba+histolytica.">Rab5-associated vacuoles play a unique role in phagocytosis of the enteric protozoan parasite Entamoeba histolytica.</a> J. Biol. Chem. 279, 49497-49507 (2004).</li><li>Diamond, L. S., Harlow, D. R., Cunnick, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+medium+for+the+axenic+cultivation+of+Entamoeba+histolytica+and+other+Entamoeba.">A new medium for the axenic cultivation of Entamoeba histolytica and other Entamoeba.</a> Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 72, 431-432 (1978).</li><li>Clark, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Anaerobic parasitic protozoa : genomics and molecular biology. , (2010).</li><li>Linford, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+hairpin+RNA-mediated+knockdown+of+protein+expression+in+Entamoeba+histolytica.">Short hairpin RNA-mediated knockdown of protein expression in Entamoeba histolytica.</a> BMC Microbiol. 9, 38-38 (2009).</li><li>Solis, C. F., Guill&#233;n, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+genes+by+RNA+interference+in+the+protozoan+parasite+Entamoeba+histolytica.">Silencing genes by RNA interference in the protozoan parasite Entamoeba histolytica.</a> Methods Mol. Biol. 442, 113-128 (2008).</li><li>Solis, C. F., Santi-Rocca, J., Perdomo, D., Weber, C., Guill&#233;n, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+bacterially+expressed+dsRNA+to+downregulate+Entamoeba+histolytica+gene+expression.">Use of bacterially expressed dsRNA to downregulate Entamoeba histolytica gene expression.</a> PLoS ONE. 4, e8424-e8424 (2009).</li><li>MacFarlane, R. C., Singh, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+dsRNA-based+gene+silencing+in+Entamoeba+histolytica:+implications+for+approaches+to+genetic+analysis.">Loss of dsRNA-based gene silencing in Entamoeba histolytica: implications for approaches to genetic analysis.</a> Exp. Parasitol. 119, 296-300 (2008).</li><li>Dhar, S. K., Vines, R. R., Bhattacharya, S., Petri, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosomal+DNA+fragments+enhance+the+stability+of+transfected+DNA+in+Entamoeba+histolytica.">Ribosomal DNA fragments enhance the stability of transfected DNA in Entamoeba histolytica.</a> J. Eukaryot. Microbiol. 45, 656-660 (1998).</li><li>Erbs, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+cancer+gene+therapy+by+adenovirus-mediated+transfer+of+a+bifunctional+yeast+cytosine+deaminase/uracil+phosphoribosyltransferase+fusion+gene.">In vivo cancer gene therapy by adenovirus-mediated transfer of a bifunctional yeast cytosine deaminase/uracil phosphoribosyltransferase fusion gene.</a> Cancer Res. 60, 3813-3822 (2000).</li><li>Braks, J. A. M., Franke-Fayard, B., Kroeze, H., Janse, C. J., Waters, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+application+of+a+positive-negative+selectable+marker+system+for+use+in+reverse+genetics+in+Plasmodium.">Development and application of a positive-negative selectable marker system for use in reverse genetics in Plasmodium.</a> Nucleic Acids Res. 34, e39-e39 (2006).</li><li>Maier, A. G., Braks, J. A. M., Waters, A. P., Cowman, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+selection+using+yeast+cytosine+deaminase/uracil+phosphoribosyl+transferase+in+Plasmodium+falciparum+for+targeted+gene+deletion+by+double+crossover+recombination.">Negative selection using yeast cytosine deaminase/uracil phosphoribosyl transferase in Plasmodium falciparum for targeted gene deletion by double crossover recombination.</a> Mol. Biochem. Parasitol. 150, 118-121 (2006).</li></ol>

Производство этого видео была организована Sigma Aldrich, Inc, которая производит одни из реагентов, используемых в этой статье.

Хотя имели место существенные достижения в области молекулярной биологии Entamoeba инструменты Есть нет доступных методов для удаления или нарушить генов 4. Нокдаун гена конкретное выражение было достигнуто за счет использования шпильки РНК 5, малых интерферирующих РНК 6 и бактериально выразил дсРНК 7. Однако эти методы в то время как в силу для соответствующих генов-мишеней, имеют ряд ограничений в том числе использования дорогостоящих химикатов, непрерывный отбор к антибиотикам и необходимость постоянной проверки в связи с высоким уровнем возврата происходящих с течением времени (Алисия Линфорд, личное сообщение) 8. Любой плазмиды могут размножаться в Entamoeba как, по-видимому, не является строгим требованием последовательность происхождения репликации ДНК 9, и поэтому, как только трансфекции, как правило, трудно вылечить плазмиды. Это ограничивает возможность использования нетронутой плазмиды в экспериментах рекомбинации генов и нокаутом. Отрицательные маркеры выбора являются ключевыми компонентами генное планирование методов, поскольку они могут быть использованы для устранения рекомбинантный субпопуляций. Мы успешно выразил кодон оптимизированы FCU1 гена в Entamoeba histolytica и испытаны свой ​​потенциал в качестве селективного маркера отрицательная. Этот ген слияния была использована для самоубийства генной терапии опухолевых клеток человека и усваивает пролекарством 5-FC в токсичные продукции глубокой переработки в результате ингибирования РНК и синтез ДНК 10. FCU1 в последнее время использовался в качестве отрицательного селективного маркера в Plasmodium, другой простейшим паразитом. Plasmodium berghei клеток, экспрессирующих FCU1 оказались почти 1000 раз более чувствительны к пролекарство в пробирке и в естественных лечение с 5-ФК погибло более 99,9% заражение рекомбинантный паразитов в эритроцитарной стадии мышиной модели заболевания малярией 11. E. histolytica клеток, экспрессирующих FCU1 показал лишь 30-кратное повышение чувствительности к пролекарством 5-ФК, в отличие от чувствительности наблюдается в P. berghei. Возможными причинами этого могут быть большого пула нуклеотидов доступны в среде роста конкуренции с токсичных метаболитов. В обоих П. berghei и П. тропической маркер FCU1 была использована в целевых генов разрушения. Исследования 11,12. Мы стремимся манипулировать геномом Entamoeba использованием гомологичной рекомбинации. Проверка FCU1/5-FC отрицательные система отбора является важным шагом на пути к этой цели.

<table border="1">
<tr>
<td>Material Name</td>
<td>Type</td>
<td>Company</td>
<td>Catalogue Number</td>
<td>Comments</td>
</tr>
<tr>
<td>TYI-S-33 medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ATCC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Reference included in the text</td>
</tr>
<tr>
<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=F7129|SIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO|BRAND_KEY&F=SPEC">5-Fluorocytosine</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>F7129</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cell tracker green CMFDA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>C2925</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Spectra Max M2 plate-reader</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		
</table>

development of a negative selectable marker for entamoeba histolytica

Entamoeba histolytica является возбудитель амебиаза и заражает до 10% населения мира. Молекулярных методов, которые позволили вверх и вниз регуляции экспрессии генов полагаться на трансфекции стабильно поддерживается плазмид. Хотя эти увеличили наше понимание факторов вирулентности Entamoeba, потенциала для интеграции экзогенной ДНК в геном, который позволил бы обратный экспериментов генетики, было бы значительное преимущество в изучении этого паразита. Проблем, возникающих в этом организме включают неспособность выбрать для гомологичной рекомбинации и трудности вылечить эписомной плазмидной ДНК из трансфицированных трофозоиты. Поздно приводит к высокой фоне экзогенной ДНК, главная проблема в идентификации трофозоиты, в которой добросовестные геномной событием интеграции не произошло. Мы сообщаем о развитии отрицательной системы отбора, основанного на трансгенных выражение дезаминазы дрожжей цитозин и урацил фосфорибозил трансферазы химера (FCU1) и выделение пролекарством 5-fluorocytosine (5-FC). Фермент FCU1 преобразует нетоксичные 5-FC в токсичные 5-фторурацила и 5-фторуридин-5&#39;-монофосфат. E. histolytica линии, экспрессирующие FCU1 оказались в 30 раз более чувствительной к пролекарство по сравнению с контролем напряжения.

Watch this Scientific Journal Video about Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica at JoVE.com

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

Мы сообщаем о развитии отрицательной системы отбора в<em&gt; Е. histolytica</em&gt; Основаны на трансгенной экспрессии химерных белков (FCU1) и выделение пролекарством 5-fluorocytosine. Белка FCU1 является слияние дрожжей дезаминазы цитозин и урацил phosphoribosyltransferase. Выражение FCU1 привело к росту<em&gt; Е. histolytica</em&gt; Чувствительности к 5-fluorocytosine.

Развитие Отрицательные Маркер для выбора Entamoeba histolytica</em

Entamoeba histolytica is the causative agent of amebiasis and infects up to 10% of the world's population. The molecular techniques that have enabled the ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

In vitro tRNA Methylation Assay with the Entamoeba histolytica DNA and tRNA Methyltransferase Dnmt2 (Ehmeth) Enzyme

In vitro tRNA Methylation Assay with the Entamoeba histolytica DNA and tRNA Methyltransferase Dnmt2 Ehmeth Enzyme

В пробирке тРНК метилирования Пробирной с Entamoeba histolytica ДНК и тРНК метилтрансферазы Dnmt2 (Ehmeth) Фермент

Protozoan parasites are among the most devastating infectious agents of humans responsible for a variety of diseases including amebiasis, which is one of ...

Examination of Thymic Positive and Negative Selection by Flow Cytometry

Экспертиза тимуса позитивной и негативной селекции с помощью проточной цитометрии

A healthy immune system requires that T cells respond to foreign  antigens while remaining tolerant to self-antigens. Random rearrangement of the  T cell ...

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

Использование химии Нажмите для оценки влияния вирусной инфекции на клетки-хозяина синтеза РНК

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

Быстрое выявление грамотрицательных бактерий из крови культуральной жидкости Использование MALDI-TOF масс-спектрометрии

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Анализ ущерба эпителиальных Продюсеры<em&gt; Entamoeba гистолитика</em&gt; Инфекция

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is ...

Detection of Human Leukocyte Antigen Biomarkers in Breast Cancer Utilizing Label-free Biosensor Technology

Обнаружение человека антиген лейкоцитов биомаркеров при раке молочной железы Используя без наклеек технологии биосенсоров

According to the American Cancer Society, more than 200,000 women will be diagnosed with invasive breast cancer each year and approximately 40,000 will ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Визуализация Эффекты мокроте на биопленки развития с использованием модели Chambered покровного стекла

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle

Разработка системы Вирус Reporter гепатита B для мониторинга на ранних стадиях цикла репликации

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), ...

Utilization of Capsules for Negative Staining of Viral Samples within Biocontainment

Использование капсул для отрицательного окрашивания вирусных образцов в области биологического обогащения

Transmission electron microscopy (TEM) is used to observe the ultrastructure of viruses and other microbial pathogens with nanometer resolution. Most ...

Simultaneous Distinction of Monospecific and Mixed DFS70 Patterns During ANA Screening with a Novel HEp-2 ELITE/DFS70 Knockout Substrate

Одновременная различия моновидовые и смешанные DFS70 моделей во время Ана скрининга с подложке Роман HEp-2 Knockout элита/DFS70

Systemic autoimmune connective tissue disorders are characterized by circulating antinuclear antibodies (ANA). Although there are several technologies ...