Name: paraffin-embedded and frozen sections of drosophila adult muscles
Uploaded: 2010-12-27T17:30:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles at JoVE.com

אנו מודים פרופ Eichele עבור ומאפשר לנו להשתמש cryo-microtome. העבודה מומנה על ידי מקס פלאנק, Gesselschaft.

1. הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין טרי מקבע של Carnoy על ידי שילוב של אתנול אבסולוטי, כלורופורם וחומצה אצטית קרחונית ביחס 6:03:01 בהתאמה. 3 זו, כמו גם את כל פתרונות הצללה קולרים יש לשמור בצנצנות זכוכית מכתים (ראה סעיף ריאגנטים המלצה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את רדיד אלומיניום כיסים את הגודל הנכון עבור הקולרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרונות הבאים מכתים צנצנות: 2 X אתנול 40%, אתנול 70%, אתנול 2 X 100%, methylbenzoate (MB), 50/50 v / v מגה פרפין, 2 X פרפין. מניחים את MB מיכלי פרפין בערכת באינקובטור עד 60-65 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרפין חם לשפוך לתוך הכיסים כדי לסכל 60-65 ° C. </li></ol> 2. תיקון זבובים קולרים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף את 4 צווארון תחת המשקפת באמצעות קלטת במצב אנכי שבו אתה יכול לראות את נקודת הכניסה עבור לטוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי זבובים באמצעות פחמן דו חמצני או באמצעות היפותרמיה באמצעות בלוק קרח. היזהרו לא להקפיא את הזבובים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים, להרים זבובים בודדים על ידי גרירה כנפיהם מקום לתוך הצווארון מכוונת כראוי (הראש ואת בית החזה על גבי להבים הבטן מתחת הלהבים). 10-20 זבובים צריך להתאים בקלות לתוך הצווארון. </li></ol> הערה: אם אתה מנתח מספר גנוטיפים, לא לשכוח לרשום את מספר צווארון גנוטיפ המקביל. 3. פרפין סעיפים של תסיסנית Thoraxes <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי מיקום צווארון לפתרון של Carnoy ולתקן את הרקמה ב 4 ° C במשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר קיבוע, מייבשים את המדגם באמצעות ריכוז גדל והולך של אתנול. במשך 10 דקות כל אחד לצלול לתוך הצווארון 40% (פי 2), 70% ו 100% (2 פעמים) אתנול בטמפרטורת החדר. צווארון דגירה הבא בפתרון + מגה מגה פרפין (1:1) למשך 30 דקות בכל אחד ואז לחדור צווארון בשני שינויים של פרפין במשך 60 דקות כל אחד ב 60-65 ° C. במהירות להעביר את הקולר לכיס לסכל ולמלא עם נמס (60-65 ° C) פרפין. מקום זה בטמפרטורת החדר ולאפשר פרפין להפוך קשה (עדיף להשאיר לילה). שים לב כי הקולר אפשר לשים בכיס לסכל ב נטיות שונות, תלוי בכיוון של חלקים אתה צריך (אורכית או רוחבית). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגולל בלוקים פרפין יבש עם צווארונים מ לסכל את ובעדינות להפריד את הצווארון מהגוש פרפין. בעזרת סכין חדה או אזמל בזהירות לחתוך את פרפין חוץ מכל רחבי הרקמה לעוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את גוש פרפין עם 7-10 סעיף צעדים מיקרומטר על microtome סיבוב ולאפשר את הרקמה לחתוך לצוף שטוח אמבטיה 37 מעלות צלזיוס המים. הנח את רקמת מחולק בשקופיות הקוטב לאפשר ייבוש במשך הלילה. שקופיות אלה יכולים לשמש מכתים עם hematoxyline ו eosin (איור 1A-D), toluidine כחול, אנילין כחול או מת אחר לדמיין מבנים רקמות, כמו גם מכתים נוגדן (איור 1E-E ``). </li></ol> 4. Cryosections של תסיסנית Thoraxes <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כמו בסעיפים פרפין, להכין את זבובים צווארון ואופנה כיס רדיד אלומיניום. מקרר מקפיא יהיה צורך להכין את דגימות. ודא כי המקרר הוא כ -60 ° C, להשתמש אתנול מעט קרח יבש, כדי לאפשר להגיע לטמפרטורה זו. שעה לפני תחילת הניסוי הניח את בקבוק בינוני הטבעה cryo (Tissue-Tek מתחם אוקטובר) במהופך מקרר 4 מעלות צלזיוס על מנת לקרר אותו למטה כדי לצמצם את היווצרות של בועות אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי מיקום צווארון זבובים לכיס לסכל כי כבר מראש מקורר במשך כמה דקות בתוך מקרר מקפיא במהירות למלא עם תרכובת cryo-הטבעת. תן להקפיא מדגם 3-10 דקות. לגולל בזהירות את הבלוק נוצר בתוך מקרר, בעדינות להפריד את הצווארון מהגוש הטבעה ושמתי אותו ב -20 מעלות צלזיוס למשך יום אחד לפחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את השרירים קפואים על cryo-microtome בין -15 ו -18 ° C עם עובי חתך של 10-15 מיקרומטר. המקום בשקופיות מקוטב ולשמור על -20 ° C עד מוכן לעשות עיבוד נוסף. אנו מציעים לתקן את הרקמה בתמיסה 4% פורמלדהיד PBS עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר לפני צביעה נוגדן. </li></ol> 5. ליפידים איתור בשרירים תסיסנית טיפות ליפידים ניתן להבחין בשמן אדום הו כתם על cryosections באמצעות פרוטוקול אימצה מן Sieber ו Thummel 5. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר קיבוע, לשטוף עם מים שקופיות פעמיים במשך 5 דקות, equilibrated ב פרופילן גליקול דקות 10 ו דגירה של כתם 3 שעות בשמן אדום O בטמפרטורת החדר. לאחר מכן לשטוף דגימות 2 דקות 5 פעמים ב פרופילן גליקול ו - 30 דקות ב-PBS. הר של גליצרול 30%. </li></ol> 6. נציג תוצאות: <img src="/files/ftp_upload/2438/2438fig1.jpg" alt="איור 1" /> תאנהיור 1. Parrafin-משובצים קטעים Hematoxyline ו eosine מוכתם רוחבי (AB) ו אורכית (CD) של השרירים החלקים טיסה עקיף. A ו-C מראה שרירי מובנה נורמלי. חריגה על ידי השרירים גודל ומורפולוגיה מיוצגים על B ו-D בהתאמה (חיצים שחורים). סעיף רוחבי של מוכתם החזה תסיסנית עם הסמן, אנטי LamC המעטפה גרעיני DAPI, גרעיני כתם (EF). תצוגה מוגדלת של רגיל (חץ אדום) הידרדר (חץ צהוב) השרירים (F). G מייצג מקטע של מוכתם תסיסנית בדרכי העיכול עם LamC ו DAPI. <img src="/files/ftp_upload/2438/2438fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. חלקים קפואים א רוחבי חלקים קפואים של בית החזה תסיסנית מוכתמים בשמן אדום O, טיפות תווית השומנים. סעיפים ב קפוא אורך של השרירים טיסה ישירה מוכתם אנטי DG, שריר sarcolemma סמן ואת DAPI.

<ol>
	<li>Miller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+internal+anatomy+and+histology+of+the+imago+of+Drosophila+melanogaster.">The internal anatomy and histology of the imago of Drosophila melanogaster.</a> , (1950).</li><li>Shcherbata, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+muscle+and+neuronal+disorders+in+a+Drosophila+model+of+muscular+dystrophy.">Dissecting muscle and neuronal disorders in a Drosophila model of muscular dystrophy.</a> The EMBO journal. 26, 481-481 (2007).</li><li>Kucherenko, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+modifier+screens+reveal+new+components+that+interact+with+the+Drosophila+dystroglycan-dystrophin+complex.">Genetic modifier screens reveal new components that interact with the Drosophila dystroglycan-dystrophin complex.</a> PloS one. 3, e2418-e2418 (2008).</li><li>Puchtler, H., Waldrop, F. S., Conner, H. M., Terry, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carnoy+fixation:+practical+and+theoretical+considerations.">Carnoy fixation: practical and theoretical considerations.</a> Histochemie. 16, 361-36 (1968).</li><li>Ashburner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila - A Laboratory Manual. , (1989).</li><li>Sieber, M. H., Thummel, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DHR96+nuclear+receptor+controls+triacylglycerol+homeostasis+in+Drosophila.">The DHR96 nuclear receptor controls triacylglycerol homeostasis in Drosophila.</a> Cell metabolism. 10, 481-481 (2009).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Stainless steel collars</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>self-made</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Specially constructed</td>
</tr>
<tr>
<td>Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools GmbH</td>
<td>11295-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Aluminum foil</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Any</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Blade or scalpel</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Any</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Wheaton macro staining jar</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Wheaton Science Products </td>
<td>900200</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microtome</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Carl Zeiss</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Model: Hyrax M25</td>
</tr>
<tr>
<td>Cryo-microtome</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leica </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Model CM3050S</td>
</tr>
<tr>
<td>60-65&deg;C Incubator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Any</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Large enough to hold at least 4 staining jars</td>
</tr>
<tr>
<td>Freezing cooler with metal block</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Any</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Store at -80&deg;C</td>
</tr>
<tr>
<td>Super-frost slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Fisher Scientific</td>
<td>9161155</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cover slips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Any </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Recommend 24 X 40 mm</td>
</tr>
<tr>
<td>Chloroform</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>288306</td>
<td>Analytical grade </td>
</tr>
<tr>
<td>Glacial acetic acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Merck</td>
<td>100063</td>
<td>Analytical grade</td>
</tr>
<tr>
<td>Ethanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Merck</td>
<td>100983</td>
<td>Analytical grade</td>
</tr>
<tr>
<td>Methylbenzoate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>M29908-500G</td>
<td>Analytical grade</td>
</tr>
<tr>
<td>Paraplast plus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>76258</td>
<td>Paraffin</td>
</tr>
<tr>
<td>Tissue-Teck O.C.T. compound</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sakura</td>
<td>4583</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>16% formaldehyde, methanol free</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Polysciences</td>
<td>18814</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glycerol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>G5150-1L</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

paraffin-embedded and frozen sections of drosophila adult muscles

אפיון מולקולארי של dystrophies ו myopathies שרירים בבני אדם חשף את המורכבות של מחלת שרירים ניתוח גנטי של מפרט שרירים, היווצרות ותפקוד במערכות מודל סיפקה תובנה חשובה הפיזיולוגיה השריר. לכן, זיהוי ואפיון המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס נזק לשרירים הוא קריטי. המבנה של מבוגר תסיסנית מרובת סיבים דומים השרירים השרירים מפוספס חוליות 1 ו נהילות הגנטי של תסיסנית עשה את זה מערכת גדולה לנתח מורפולוגיה שריר dystrophic ולאפיין את התהליכים המשפיעים על תפקוד השרירים הבוגרים הזדקנות זבובים 2. כאן אנו מציגים את הטכניקה היסטולוגית להכנת פרפין משובצים ו קפוא קטעי תסיסנית שרירי החזה. הכנות אלו מאפשרות הרקמה להיות מוכתם בכתמי היסטולוגית קלאסית שכותרתו עם צבעים חלבון גילוי, ובמיוחד cryosections הם אידיאליים עבור זיהוי immunohistochemical של חלבונים בשרירים ללא פגע. זה מאפשר ניתוח של מבנה רקמת השריר, זיהוי פגמים מורפולוגיים, זיהוי של דפוס הביטוי של שריר / עצב ספציפי חלבונים בשרירים תסיסנית מבוגר. טכניקות אלה יכולים גם להיות שונה במקצת עבור חתך של חלקי גוף אחרים.

Watch this Scientific Journal Video about Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles at JoVE.com

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

זיהוי המנגנונים נזק לשרירים הוא קריטי. כאן אנו מציגים את הטכניקה היסטולוגית להכנת פרפין משובצים ו קפוא קטעי תסיסנית שרירי החזה. זה מאפשר ניתוח של מורפולוגיה שרירים לוקליזציה של חלבונים אחרים בתא השריר המרכיבים.

מדורים פרפין-Embedded קפואים של תסיסנית סקס שרירים

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

Research

JoVE Journal

Biology

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Whole Cell Recordings from Brain of Adult Drosophila

תא הקלטות שלמות של המוח של מבוגרים תסיסנית

In this video, we demonstrate the procedure for isolating whole brains from adult Drosophila in preparation for recording from single neurons. We begin by ...

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

וידאו ברזולוציה גבוהה של מעקב אחר תנועה של מבוגרים תסיסנית melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

הכנת פיתוח למבוגרים תסיסנית מוח רשתיות עבור הדמיה חיה

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three ...

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

Dissection של Oenocytes מן למבוגרים תסיסנית melanogaster</em

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides ...

DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

הפקת DNA מחומר פרפין Embedded עבור ניתוח גנטי epigenetic

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number ...

Preparation of Adult Drosophila Eyes for Thin Sectioning and Microscopic Analysis

Preparation of Adult Drosophila Eyes for Thin Sectioning and Microscopic Analysis

הכנת למבוגרים תסיסנית עיניים עבור חתך דק ניתוח מיקרוסקופי

Drosophila has long been used as model system to study development, mainly due to the ease with which it is genetically tractable. Over the years, a ...

Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

לדוגמא הכנת proteomic מפורמלין קבועה ורקמות פרפין Embedded

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale ...

qPCR Is a Sensitive and Rapid Method for Detection of Cytomegaloviral DNA in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Biopsy Tissue

qPCR הוא שיטה רגישה ומהירה לאיתור של Cytomegaloviral DNA בקבועה פורמלין, רקמות ביופסיה מוטבעות פרפין

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for ...

Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland

Immunofluorescence עקיף על סעיפים קפואים של עכבר בלוטת החלב

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple ...

Employing Digital Droplet PCR to Detect BRAF V600E Mutations in Formalin-fixed Paraffin-embedded Reference Standard Cell Lines

העסקת דיגיטלי אגל PCR לזיהוי מוטציות V600E BRAF בשורות תאי ההפניה תקן קבוע פורמלין מוטבע-פרפין

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is ...